周 佳，許倩倩，楊躍飛，王彥紅,3

(1. 揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009 ； 2. 揚(yáng)州大學(xué) 江蘇高校動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009 ； 3. 江蘇省人獸共患病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州 225009)

大腸埃希菌(Escherichiacoli，E.coli)俗稱大腸桿菌，是一種常見的致病菌。由于抗菌藥的頻繁使用，導(dǎo)致動(dòng)物養(yǎng)殖環(huán)境中致病性大腸桿菌耐藥菌株大量產(chǎn)生。這些耐藥菌通過多種途徑進(jìn)行傳播,或?qū)⑵淠退幓蛲ㄟ^畜禽產(chǎn)品直接傳遞給人類致病菌，引起交叉耐藥,對(duì)人類健康構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅[1]。

氨基糖苷類抗菌藥屬于廣譜抗菌藥，具有高效、藥物動(dòng)力學(xué)優(yōu)良和與其他抗菌藥物有協(xié)同作用等特點(diǎn)，是治療大腸桿菌感染的常用藥物。氨基糖苷類抗菌藥可作用于原核細(xì)胞核糖體30S亞單位中16S rRNA的A位，使細(xì)菌在合成蛋白的過程中發(fā)生錯(cuò)誤翻譯，錯(cuò)誤的蛋白質(zhì)插入細(xì)胞膜造成其斷裂從而使細(xì)胞內(nèi)重要物質(zhì)外漏，細(xì)胞迅速死亡[2]。但因?yàn)榘被擒疹愃幬镌谂R床治療中的過度使用和不合理使用，對(duì)其耐藥的臨床分離株越來越多。細(xì)菌對(duì)氨基糖苷類藥物的耐藥機(jī)制主要有3種：改變細(xì)胞膜通透性、激活外排泵系統(tǒng),使抗菌藥物在細(xì)菌胞體內(nèi)積聚量減少；產(chǎn)生氨基糖苷類藥物修飾酶，滅活藥物；核糖體結(jié)合位點(diǎn)的改變，包括A位點(diǎn)的突變和16S rRNA甲基化酶對(duì)靶位點(diǎn)的修飾作用[3]。本試驗(yàn)選取大腸桿菌aac(3)-II、arm(A)和aac(6′)-Ib三種耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)分析，以期為大腸桿菌耐藥性的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料來源 采集2018年1—3月?lián)P州大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院畜禽門診和寵物門診的送檢病例，共收集115例病例的病料，送檢病例包括雞29例，鵝32例，犬25例，貓15例，豬10例，兔1例，鴿3例。畜禽門診病例取病死動(dòng)物(如雞、鵝和豬)的肝和脾等組織作為病料，寵物門診病例取送檢樣品(如子宮蓄膿或有尿道炎癥的樣品)的犬貓尿樣作為病料。

1.2 主要試劑與儀器 生化鑒定管、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和藥敏試紙片，均購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；PCR試劑盒，購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；TaKaRa LATaq酶、dNTP Mixture、10×LA PCR BufferⅡ (Mg2+plus)、100 bp DNA Ladder、Super GelRed 10 000×in Water、10× Ladder Buffer,均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。超凈工作臺(tái)(型號(hào)為SW-CJ-IL),購(gòu)自蘇州凈化工作臺(tái)設(shè)備有限公司；恒溫培養(yǎng)箱(型號(hào)為GNP9080),購(gòu)自上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司；DNA擴(kuò)增儀(型號(hào)為4484073)，購(gòu)自北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司；凝膠電泳儀(型號(hào)為DYCP-31DN)，購(gòu)自北京六一生物科技有限公司。

1.3 細(xì)菌分離和鑒定 將采集來的病料劃線于麥康凱平板，37 ℃培養(yǎng)18 h；挑取典型菌落在麥康凱平板上分區(qū)劃線，37 ℃培養(yǎng)18 h，再挑取單個(gè)菌落經(jīng)革蘭染色，顯微鏡觀察其形態(tài)。將純化后的細(xì)菌接種到各生化發(fā)酵管中培養(yǎng)并進(jìn)行靛基質(zhì)試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)和枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)(即IMViC試驗(yàn))。

1.4 藥敏試驗(yàn) 藥敏試驗(yàn)判斷標(biāo)準(zhǔn)采用美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standard Institute,CLSI)2013年推薦的抗菌藥物敏感試驗(yàn)紙片法[4]。檢測(cè)分離菌對(duì)β-內(nèi)酰胺藥物、氨基糖苷類藥物、氟喹諾酮類藥物、磺胺類藥物共7大類18種藥物的耐藥情況。采用WHONET 5.6軟件對(duì)藥敏試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.5 耐藥基因檢測(cè) 參照參考文獻(xiàn)[5-7]設(shè)計(jì)aac(3)-II、arm(A)和aac(6′)-Ib基因的引物，引物由生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成。分離菌株按照煮沸裂解法提取DNA，以DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：10× Buffer 2 μL，dNTP 0.4 μL，上、下游引物各0.2 μL，Taq酶0.2 μL，滅菌雙蒸水補(bǔ)充至20 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性4 min[aac(3)-II和aac(6′)-Ib]或5 min[arm(A)]；94 ℃變性45 s[aac(3)-II和aac(6′)-Ib]或1 min[arm(A)],52 ℃[aac(3)-II]或53 ℃[aac(6′)-Ib和arm(A)]退火 45 s，72 ℃延伸50 s[aac(3)-II和aac(6′)-Ib]或1 min[arm(A)],共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃再延伸8 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。其中aac(6′)-Ib檢測(cè)陽(yáng)性產(chǎn)物送至南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果上傳至GenBank進(jìn)行比對(duì)，分析其是否發(fā)生變異。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離和鑒定 采集樣品經(jīng)麥康凱平板劃線培養(yǎng)后，培養(yǎng)基上有圓形、表面光滑的粉紅色菌落生長(zhǎng)。革蘭染色后鏡檢可觀察到革蘭陰性桿菌。分離菌株IMViC試驗(yàn)結(jié)果為“+、+、-、-”，與大腸桿菌生化特性一致。從115例病例的病料中共分離出65株大腸桿菌，包括鵝源19株，雞源18株，犬源11株，豬源10株，貓?jiān)?株，鴿源2株,兔源1株。

2.2 藥敏試驗(yàn) 65株大腸桿菌分離菌株的耐藥情況見表1，分離菌株對(duì)鏈霉素、復(fù)方新諾明、阿莫西林、慶大霉素、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、氟苯尼考和多西環(huán)素耐藥率均高于50.00%，耐藥率最高的為鏈霉素(75.38%)，其次為復(fù)方新諾明(69.23%)，最低為頭孢哌酮舒巴坦(0%)。不同動(dòng)物對(duì)藥物的耐藥程度略不同，氨基糖苷類阿米卡星、慶大霉素、卡那霉素、新霉素、鏈霉素和妥布霉素的耐藥率在鵝源大腸桿菌上分別是11.11%(2/18)、17.14%(6/35)、14.29%(4/28)、22.22%(6/27)、28.57%(14/49)和25.00%(7/28)；雞源大腸桿菌上分別為50.00%(9/18)、37.14%(13/35)、35.71%(10/28)、48.15%(13/27)、32.65%(16/49)和32.14%(9/28)；在犬源大腸桿菌上分別是22.22%(4/18)、20.00%(7/35)、17.86%(5/28)、11.11%(3/27)、12.25%(6/49)和17.86%(5/28)；在豬源大腸桿菌上分別是11.11%(2/18)、20.00%(7/35)、21.43%(6/28)、14.81%(4/27)、18.37%(9/49)和14.29%(4/28)；在貓?jiān)创竽c桿菌上分別是5.56%(1/18)、2.86%(1/35)、3.57%(1/28)、0、4.08%(2/49)和3.57%(1/28)；在鴿源大腸桿菌中分別是0、2.86%(1/35)、7.14%(2/28)、3.70%(1/27)、4.08%(2/49)和7.14%(2/28)；兔源大腸桿菌對(duì)氨基糖苷類藥物敏感。

表1 65株大腸桿菌分離菌株的耐藥性分析

2.3 耐藥基因檢測(cè) 對(duì)65株大腸桿菌分離株進(jìn)行aac(3)-II、arm(A)和aac(6′)-Ib耐藥基因檢測(cè)，部分菌株分別擴(kuò)增出了412、482和315 bp目的條帶。統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2，14株分離菌株僅aac(3)-II基因呈陽(yáng)性(21.54%，14/65)，其中3株為鵝源，5株為雞源，2株為犬源，4株為豬源；1株分離菌株僅攜帶aac(6′)-Ib-cr5基因(1.54%，1/65)，為貓?jiān)矗?株分離菌株同時(shí)攜帶aac(3)-II和aac(6′)-Ib-cr5基因(6.15%，4/65)，其中2株為鵝源，2株為豬源；1株分離菌株同時(shí)攜帶aac(3)-II、aac(6′)-Ib-cr5和arm(A)基因，為鵝源；而鴿源和兔源均沒有攜帶檢測(cè)的3種基因。

表2 65株大腸桿菌分離株耐藥基因的PCR檢測(cè)

2.4 多重耐藥分析 65株動(dòng)物源大腸桿菌分離菌株中51株對(duì)3類及以上的藥物表現(xiàn)耐藥，呈多重耐藥，其中雞源占比最多，為27.69%，其次為鵝源(21.54%)(表3)。

表3 65株大腸桿菌分離株的多重耐藥比率

3 討論

本試驗(yàn)從115例臨床送檢病例中共分離出65株大腸桿菌，鵝源、雞源、鴿源分離率都超過了50%；藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，氨基糖苷類抗菌藥中鏈霉素耐藥率最高，為75.38%；阿米卡星最低，為27.69%；然而，雞源大腸桿菌對(duì)其中幾種氨基糖苷類抗菌藥耐藥率較高，分別為阿米卡星50.00%(9/18)、慶大霉素37.14%(13/35)、卡那霉素35.71%(10/28)、新霉素48.15%(13/27)，此氨基糖苷類抗菌藥耐藥性比展天松等[8]、朱永江等[9]的研究結(jié)果略有上升。本試驗(yàn)?zāi)退幓驒z測(cè)結(jié)果與他人研究結(jié)果[8,9]相似，aac(3)-II是江蘇地區(qū)氨基糖苷類主要流行基因，aac(3)-II能修飾慶大霉素和妥布霉素，aac(3)-II與慶大霉素的符合率為54.29%，與妥布霉素的符合率為67.86%，二者存在差異表明雖然多種氨基糖苷類藥物可以被一種鈍化酶修飾，然而酶對(duì)底物有嚴(yán)格的選擇性，這會(huì)造成其反應(yīng)的速度不一致，最終使得其耐藥性發(fā)生了較大的差異[8]。aac(6′)-Ib在遼寧和廣西等地區(qū)豬源大腸桿菌中攜帶率較高[10，11]。aac(6′)-Ib能修飾阿米卡星、妥布霉素和卡那霉素，氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶的變異基因aac(6′)-Ib-cr能使氨基糖苷類藥物和氟喹諾酮類藥物同時(shí)失活。該基因編碼的滅活酶可使環(huán)丙沙星和諾氟沙星中的氨基氮發(fā)生乙?；?從而使其抗菌活性下降[5]。較多研究表明，大腸桿菌中aac(6′)-Ib出現(xiàn)變異可增加對(duì)環(huán)丙沙星的耐藥[5，10，12]。本試驗(yàn)中6株攜帶aac(6′)-Ib-cr基因的分離菌株對(duì)環(huán)丙沙星和諾氟沙星耐藥均為100%。本試驗(yàn)65株大腸桿菌分離菌株中共有51株呈多重耐藥，其中雞源多重耐藥的情況最普遍，可能與雞在飼養(yǎng)過程中抗菌藥物的用量大、種類多和頻率高有關(guān)，導(dǎo)致雞源的耐藥水平偏高。分析大腸桿菌對(duì)氨基糖苷類藥物的耐藥性并檢測(cè)其耐藥基因，有利于預(yù)測(cè)大腸桿菌潛在的耐藥問題，從而對(duì)指導(dǎo)臨床合理用藥具有十分重要的意義。