龍 鑫，候建平，鄭思思，李佳妮，王 穩(wěn)，朱麗琳

(1. 青海大學(xué) 省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016 ；2. 西寧市野生動(dòng)物疫源疫病監(jiān)測(cè)站，青海 西寧 810001)

高原兔(Lepusoiostolus)又名灰尾兔，隸屬于兔形目，兔科，主要分布于我國(guó)青藏高原及其毗鄰地區(qū)，是世界上分布海拔最高的兔種。目前，關(guān)于野生高原兔的生理研究偏少，主要集中于形態(tài)學(xué)觀察、生活習(xí)性、種群數(shù)量及人工防控、棲息地利用等內(nèi)容[1]。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群與動(dòng)物宿主的神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)存在相互調(diào)控，進(jìn)而與宿主的發(fā)育、免疫、代謝等諸多生理過(guò)程及眾多疾病的發(fā)生存在關(guān)聯(lián)[2]?；诖?，深入了解高原兔腸道菌群的組成及功能在其生理生態(tài)學(xué)研究中具有重要意義。目前，16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序、宏基因組、培養(yǎng)基分離培養(yǎng)等技術(shù)手段被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物腸道微生物研究[3]。本試驗(yàn)利用16S rDNA高通量測(cè)序方法，分析高原兔小腸與大腸部位菌群種類(lèi)及相對(duì)豐度，同時(shí)利用不同培養(yǎng)基對(duì)高原兔新鮮糞便中的微生物進(jìn)行分離培養(yǎng)，獲得可培養(yǎng)的腸道微生物菌株，并進(jìn)一步對(duì)獲得的菌株進(jìn)行耐藥性檢測(cè)。本試驗(yàn)結(jié)果有助于豐富對(duì)高原兔腸道微生物的認(rèn)識(shí)，并為高原兔生理生態(tài)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 LB瓊脂和肉湯、MRS瓊脂和肉湯、M17瓊脂和肉湯、乳酸桿菌選擇性培養(yǎng)基(LBS)瓊脂和肉湯，均購(gòu)自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、2 ×TaqPCR Master Mix和DL 2 000 Marker，均購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；大腸埃希菌(EscherichiacoliATCC8099)、腸炎沙門(mén)菌(SalmonellaenteritidisCMCC 50041)、金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC6538)、痢疾志賀氏菌(ShigelladysenteriaeCMCC 51105)和銅綠假單胞菌(PseudomonasaeruginosaCMCC 10104)，均購(gòu)自北京醫(yī)田生物技術(shù)有限公司；34種藥敏紙片，均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。

1.2 主要儀器 KG-SX-500高壓滅菌鍋，購(gòu)自上海珂淮儀器有限公司；SW-CJ-1FD無(wú)菌超凈臺(tái)、NRY-2102C恒溫培養(yǎng)箱和搖床，均購(gòu)自上海昕?jī)x儀器儀表有限公司；UV-3600Plus紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，購(gòu)自屹譜儀器制造(上海)有限公司；ProFlex PCR儀，購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司。

1.3 試驗(yàn)材料 利用網(wǎng)捕法在青海省海北藏族自治州海晏縣境內(nèi)捕獲高原兔2只，及時(shí)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，用注射空氣造成氣體栓塞方法處死后，在實(shí)驗(yàn)室無(wú)菌條件下進(jìn)行剖檢。采集小腸段和大腸段內(nèi)容物共4份樣本，凍存于-80 ℃冰箱，用于16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序。同時(shí)采集高原兔新鮮糞便數(shù)枚，混合后置于4 ℃冰箱，用于腸道微生物分離培養(yǎng)。動(dòng)物捕獲及樣本采集嚴(yán)格遵守青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的相關(guān)規(guī)定。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序及生物信息分析 所有待測(cè)小腸段和大腸段內(nèi)容物樣本按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作方法，進(jìn)行微生物基因組DNA的提取。利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽提的基因組DNA。以微生物基因組DNA為模板，對(duì)細(xì)菌16S rDNA的V4～V5區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增。由北京奧維森基因科技有限公司進(jìn)行基于MiSeq平臺(tái)(PE 2×300 bp)的16S rDNA建庫(kù)和高通量測(cè)序。

生物信息分析：首先，對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行一系列質(zhì)量控制，得到可用于后續(xù)分析的高質(zhì)量純凈序列(Clean reads)。然后，進(jìn)行操作分類(lèi)單元(Operational Taxonomic Units，OTU)分析，使用Uparse(Version 7.0.1090)方法進(jìn)行OTU聚類(lèi)，序列相似性設(shè)為97%，得到OTU代表序列。使用Usearch_global方法將優(yōu)化序列比對(duì)OTU代表序列，得到各個(gè)樣品的OTU序列豐度統(tǒng)計(jì)表。為了得到每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的物種分類(lèi)信息，采用RDP classifier(Version 2.2)對(duì)97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行物種組成分析，置信度閾值設(shè)為0.8，并在各個(gè)分類(lèi)水平(界、門(mén)、綱、目、科、屬)統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣本的微生物群落組成。細(xì)菌分類(lèi)比對(duì)的參考數(shù)據(jù)庫(kù)是Silva 16S rRNA database(Release128 http://www.arb-silva.de)。最后利用R語(yǔ)言繪制OTU水平韋恩圖。

1.4.2 細(xì)菌分離與純化 在無(wú)菌條件，將高原兔糞便樣本放入1 mL無(wú)菌水中，3 000 r/min離心5 min。取離心后懸液100 μL，從10倍開(kāi)始對(duì)懸液進(jìn)行10倍梯度稀釋至109倍。分別取稀釋倍數(shù)為10、103、105、107和109的懸液涂布在LB、MRS、M17和LBS瓊脂培養(yǎng)基表面，有氧條件下，在培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)24～48 h。挑選表征(顏色、大小、形狀)不同的單菌落在上述肉湯中培養(yǎng)12 h后，再次在相應(yīng)的瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行單菌落培養(yǎng)分離。重復(fù)上述步驟5次，直至得到純化的單菌落。

1.4.3 基于16S rRNA基因的菌種鑒定 提取純化單菌落總DNA，利用細(xì)菌16S rRNA基因通用擴(kuò)增引物對(duì)[上游引物7F：5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′；下游引物1540R：5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成]進(jìn)行PCR擴(kuò)增。取10 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。將PCR擴(kuò)增陽(yáng)性的產(chǎn)物送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行一代測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果基于NCBI的BLAST程序進(jìn)行序列相似性比對(duì)，明確細(xì)菌的分類(lèi)水平。并將同一種細(xì)菌的最長(zhǎng)序列作為代表性序列提交至NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)。運(yùn)用MEGA X軟件，以Maximum composite likelihood模型計(jì)算遺傳距離，采用鄰接法(Neighbor-joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，Bootstrap自展1 000次檢驗(yàn)進(jìn)化樹(shù)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)置信區(qū)間，以痰液彎曲菌(Campylobactersputorumstrain ATCC 33709)為外類(lèi)群。

1.4.4 藥敏試驗(yàn) 采用藥敏紙片瓊脂擴(kuò)散法(K-B法)，將麥?zhǔn)隙日{(diào)節(jié)為0.5的菌液均勻涂在瓊脂培養(yǎng)基上，貼上34種藥敏紙片，每種藥敏紙片重復(fù)3片。培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)14 h后測(cè)量抑菌圈直徑，并依據(jù)中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《抗菌藥物敏感性試驗(yàn)的技術(shù)要求(WS/T 639—2018)》[4]判定結(jié)果。

1.4.5 抑菌試驗(yàn) 利用牛津杯法測(cè)定2種潛在有益菌株對(duì)5種病原菌的抑菌圈大小。分別在LB和LBS瓊脂平板上加入50 μL病原菌菌液，并涂布均勻。在培養(yǎng)基表面等距離擺放牛津杯并輕輕按壓，使其與培養(yǎng)基接觸無(wú)空隙。在牛津杯中加入2種潛在有益菌株菌液各200 μL，培養(yǎng)24 h后，測(cè)定抑菌圈的大小。每種菌株做3次重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1 16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序及生物信息分析 高原兔小腸部位的菌群在菌門(mén)水平主要由擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)22.30%、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)20.02%、互養(yǎng)菌門(mén)(Synergistetes)2.92%、放線菌門(mén)(Actinobacteria)1.07%組成；大腸部位的菌群在菌門(mén)水平主要由厚壁菌門(mén)16.70%、放線菌門(mén)14.24%、擬桿菌門(mén)11.43%、藍(lán)細(xì)菌門(mén)(Cyanobacteria)1.87%組成(圖1A)。高原兔小腸部位相對(duì)豐度大于1.00%的菌屬包括：理研菌科RC9腸道群(RikenellaceaeRC9 gut group)8.47%、擬桿菌屬(Bacteroides)7.89%、克里斯滕森菌科R-7群(ChristensenellaceaeR-7 group)7.26%、dgA-11 gut group 2.87%、金字塔桿菌屬(Pyramidobacter)2.28%、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)2.21%、月形單胞菌屬(Selenomonas)1.78%、芽孢桿菌屬(Bacillus)1.39%、副擬桿菌屬(Parabacteroides)1.21%、臭味桿菌屬(Odoribacter)1.21%；高原兔大腸部位相對(duì)豐度大于1.00%的菌屬包括：腸桿菌屬(Enterorhabdus)10.28%、擬桿菌屬7.33%、芽孢桿菌屬3.44%、克里斯滕森菌科R-7群3.04%、紅蝽?xiàng)U菌科UCG-002屬(CoriobacteriaceaeUCG-002)1.64%、理研菌科RC9腸道群1.54%、副擬桿菌屬1.13%(圖1B)。OTU水平的韋恩圖顯示，高原兔小腸和大腸部位微生物OTU總數(shù)為452，小腸部位微生物OTU數(shù)小于大腸部位微生物OTU數(shù)，2個(gè)部位共有微生物OTU數(shù)高達(dá)254(圖2)。

圖1 高原兔小腸和大腸部位菌群在門(mén)水平(A)和屬水平(B)上的組成

圖2 高原兔小腸和大腸部位菌群OTU分布韋恩圖

2.2 細(xì)菌分離與純化以及基于16S rRNA基因的菌種鑒定 經(jīng)5輪純化后，最終獲得25個(gè)單菌落。經(jīng)生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行一代測(cè)序后，獲得所有25個(gè)單菌落的16S rRNA基因序列。將所有測(cè)序序列利用NCBI的BLAST程序進(jìn)行序列相似性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)這些菌株隸屬于3門(mén)、6屬、9種，分別是萎縮芽孢桿菌(Bacillusatrophaeus)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、運(yùn)動(dòng)芽孢桿菌(Bacillusmobilis)、耐久腸球菌(Enterococcusdurans)、蒙氏腸球菌(Enterococcusmundtii)、托爾豪特鏈球菌(Streptococcusthoraltensis)、大腸埃希菌(Escherichiacoli)、神戶腸桿菌(Enterobacterkobei)、檸檬節(jié)桿菌(Arthrobactercitreus)。將上述每個(gè)種的最長(zhǎng)序列作為代表性序列提交到NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)獲得登錄號(hào)，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。由圖3可知，不同分離菌株與相應(yīng)參考菌株親緣關(guān)系較近，均處系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)同一分支。

圖3 基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.3 藥敏試驗(yàn) 結(jié)果如表1所示，9種菌株對(duì)3～27種抗菌藥物表現(xiàn)出耐藥性。其中，耐久腸球菌、蒙氏腸球菌、運(yùn)動(dòng)芽孢桿菌、神戶腸桿菌可耐受的抗菌藥物至少有14種，而托爾豪特鏈球菌、萎縮芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌可耐受的抗菌藥物低于5種。進(jìn)一步從抗菌藥物抑制細(xì)菌的角度進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)有15種抗菌藥物能夠抑制本試驗(yàn)中分離的6～9種菌株，分別是哌拉西林、頭孢西丁、甲氧芐胺嘧啶、頭孢他啶、頭孢拉定、厄他培南、諾氟沙星、氨芐青霉素、頭孢唑林、丁胺卡那、鏈霉素、氧氟沙星、環(huán)丙氟哌酸、多西環(huán)素、左氧氟沙星；其中左氧氟沙星可抑制分離到的9種菌株；而吉他霉素、氨曲南、克林霉素、制霉菌素、林可霉素對(duì)6～9種分離菌株無(wú)抑制作用，其中制霉菌素和林可霉素對(duì)所有分離到的菌株均無(wú)抑制作用。

表1 分離菌株藥敏試驗(yàn)

續(xù)表

2.4 抑菌試驗(yàn) 選取本試驗(yàn)分離到的2株腸球菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。由圖4可知，蒙氏腸球菌對(duì)5種腸道病原菌均有一定的抑制效果，尤其對(duì)腸炎沙門(mén)菌、銅綠假單胞菌的抑制效果較好；耐久腸球菌對(duì)腸炎沙門(mén)菌、金黃色葡萄球菌的抑制效果較好，而對(duì)另外3種腸道病原菌無(wú)抑制效果。

圖4 兩種菌株對(duì)5種腸道病原菌的抑制效應(yīng)

3 討論

本試驗(yàn)綜合利用16S rDNA高通量測(cè)序技術(shù)和細(xì)菌培養(yǎng)分離技術(shù)，分別從腸道微生物種類(lèi)和分離菌株耐藥性、抑菌性2個(gè)方面揭示高原兔腸道菌群特征。16S rDNA高通量測(cè)序結(jié)果揭示高原兔小腸和大腸部位微生物組成的整體特征，小腸部位菌群主要由厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)組成；大腸部位菌群除上述2種菌門(mén)外，還包括放線菌門(mén)。該結(jié)果與宋冰等[5]對(duì)工廠兔、散養(yǎng)兔和野兔盲腸菌群研究結(jié)果一致。這3種菌門(mén)也是脊椎動(dòng)物普遍共棲的腸道微生物類(lèi)別[2]。屬水平結(jié)果顯示，小腸和大腸部位微生物的優(yōu)勢(shì)菌群在種類(lèi)上存在一定相似性，均含有擬桿菌屬、芽孢桿菌屬、克里斯滕森菌科R-7群、理研菌科RC9腸道群、副擬桿菌屬。食性被認(rèn)為是影響動(dòng)物腸道菌群組成的重要因素之一，動(dòng)物借助腸道菌群消化、吸收食物中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)而適應(yīng)其特有食性[6]。高原兔的植食特性有利于在纖維物質(zhì)消化中起主要作用的厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)細(xì)菌在腸道內(nèi)定殖和生長(zhǎng)[7]。比如，擬桿菌門(mén)的擬桿菌屬被認(rèn)為與纖維素、淀粉和果膠等復(fù)雜多糖消化有關(guān)[8]。Tavella等[9]研究表明，大量的克里斯滕森菌與理研菌科成員通過(guò)降低內(nèi)臟脂肪含量對(duì)相關(guān)的心血管和代謝性疾病產(chǎn)生保護(hù)效應(yīng)，進(jìn)而對(duì)機(jī)體健康發(fā)揮有益作用。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高原兔小腸與大腸部位存在特異OTU，可能與腸道不同部位的結(jié)構(gòu)和生理功能有關(guān)。而高達(dá)56.19%的OTU為高原兔小腸與大腸共有，提示這些微生物穩(wěn)定存在于高原兔腸道微生物群落中，可能發(fā)揮核心生理功能。未來(lái)可借助宏基因組學(xué)手段深入研究核心菌群的基因功能和代謝通路等。

基于細(xì)菌培養(yǎng)分離技術(shù)，本試驗(yàn)利用4種培養(yǎng)基共獲得9種高原兔腸道菌株，隸屬于3門(mén)、6屬。目前，培養(yǎng)組學(xué)多應(yīng)用于人體、經(jīng)濟(jì)動(dòng)物和模式動(dòng)物的腸道菌群培養(yǎng)，野生動(dòng)物腸道菌群的培養(yǎng)工作相對(duì)滯后。較之于菌群高通量測(cè)序結(jié)果，本試驗(yàn)分離的菌株較少。究其原因，一方面，本試驗(yàn)使用的培養(yǎng)基類(lèi)型及培養(yǎng)條件較為單一，難以覆蓋絕大多數(shù)菌株的生長(zhǎng)條件；另一方面，本試驗(yàn)以糞便為材料進(jìn)行菌群培養(yǎng)，并不能完全代表真實(shí)的腸道菌群狀況。本試驗(yàn)分離菌株中，神戶腸桿菌、蒙氏腸球菌、托爾豪特鏈球菌、檸檬節(jié)桿菌所占比例較高。王恩召等[10]研究發(fā)現(xiàn)，神戶腸桿菌可通過(guò)釋放3-甲基丁酸進(jìn)而對(duì)小孢根霉(Rhizopusmicrosporus)產(chǎn)生抑制作用。王雅君等[11]從雉雞嗉囊中分離篩選到1株蒙氏腸球菌Sna，具有較強(qiáng)的抗氧化活性和膽固醇清除活性。托爾豪特鏈球菌為條件致病菌，可引起膿胸、感染性心內(nèi)膜炎、菌血癥等[12]。李俊琴[13]分離的藏羚羊和高原鼠兔腸道菌群中，檸檬節(jié)桿菌是二者共有的優(yōu)勢(shì)菌種。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的2種腸球菌，蒙氏腸球菌和耐久腸球菌，對(duì)5種常見(jiàn)腸道致病菌表現(xiàn)出一定的抑制能力，提示未來(lái)潛在的應(yīng)用價(jià)值[14]。以上結(jié)果表明，高原兔腸道菌群中致病菌和有益菌共存，是高原兔宿主與腸道菌群協(xié)同演化、相互適應(yīng)的結(jié)果。這些分離菌株豐富了高原兔可培養(yǎng)腸道菌株資源，不僅為進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)條件以分離更多高原兔源菌株提供參考，而且為適于家兔養(yǎng)殖業(yè)的高原兔源有益菌株研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

動(dòng)物源細(xì)菌的抗菌藥耐藥性在全球范圍內(nèi)蔓延，耐藥細(xì)菌和耐藥基因在“動(dòng)物、食品、環(huán)境和人群”鏈條內(nèi)流通，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)公共衛(wèi)生安全[15]。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，9種分離菌株對(duì)3～27種抗菌藥物表現(xiàn)出耐藥性，而制霉菌素、林可霉素對(duì)所有分離到的菌株均無(wú)抑制作用。因此推測(cè)高原兔腸道耐藥菌株可能來(lái)自與其共享草地及水源的牦牛、藏羊等家養(yǎng)動(dòng)物。高原畜牧養(yǎng)殖業(yè)中廣泛使用的治療性抗菌藥使得家養(yǎng)動(dòng)物腸道菌群面臨高選擇性壓力，產(chǎn)生耐藥菌株和耐藥基因，并隨著家養(yǎng)動(dòng)物糞便轉(zhuǎn)移至高原生態(tài)環(huán)境中，進(jìn)一步導(dǎo)致耐藥菌株和耐藥基因在不同高原野生動(dòng)物之間傳播[16]。本試驗(yàn)結(jié)果增添了對(duì)高原兔腸道菌株耐藥性的新認(rèn)識(shí)，為后續(xù)深入探討“高原家養(yǎng)動(dòng)物糞便—環(huán)境(土壤、水源、草地)—野生動(dòng)物”的潛在傳播路徑提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。