盧勁曄，顧蓓蓓，法艷梅，劉 靜，何祥來

[1. 江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300 ； 2. 泰州海關(guān)綜合技術(shù)服務(wù)中心，江蘇 泰州 225300 ；3. 青島西海岸新區(qū)(黃島區(qū))農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，山東 青島 266427]

乳腺炎是困擾奶牛養(yǎng)殖業(yè)并造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失的重要疾病之一。乳腺炎的防治效果不僅關(guān)系到奶牛養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益，更為重要的是與公眾食品安全和人類健康密切相關(guān)[1]。大腸埃希菌(Escherichiacoli，E.coli)是臨床上引起奶牛乳腺感染最重要的病原菌之一，也是環(huán)境性乳腺炎病原菌的代表?？咕庮l繁使用致使耐藥菌株的不斷產(chǎn)生，增加了臨床上乳腺炎防治的難度[2,3]。脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)是大腸埃希菌細(xì)胞膜的主要元件，通過Toll樣受體4(Toll-like receptors 4，TLR4)促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，激活核因子κB(Nuclear transcription factor-κB,NF-κB)，增加炎性細(xì)胞因子的分泌，進(jìn)一步促進(jìn)乳腺炎的發(fā)展[4-6]。有趣的是，作為乳腺組織的主要功能細(xì)胞，乳腺上皮細(xì)胞不僅在乳汁的合成和分泌中起著重要作用，還是一種重要的病原體屏障[7，8]。因此，探討乳腺上皮細(xì)胞的自身防御機(jī)制對預(yù)防炎癥具有重要意義。

微RNA(microRNAs,miRNAs)是一類由21～23個(gè)堿基組成的單鏈小RNA分子，具有高度的保守性。miRNAs在轉(zhuǎn)錄后起重要作用，與靶基因特異性結(jié)合后通過降解或抑制mRNA調(diào)控靶基因的表達(dá)[9，10]。研究表明，miRNA通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、凋亡和免疫防御反應(yīng)在動(dòng)物抵御乳腺感染中發(fā)揮了重要作用[11，12]。Wang等研究表明，牛miR-146a可通過靶向調(diào)節(jié)TRAF6基因增加乳腺上皮細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)，提高乳腺上皮細(xì)胞的免疫應(yīng)答水平[13]。Lai等研究發(fā)現(xiàn)，miR-92a可作為奶牛乳腺炎的標(biāo)記分子[14]。Sun等研究表明，奶牛乳腺炎發(fā)生時(shí)miR-142-5p表達(dá)上調(diào)[15]。然而miRNA在乳腺炎發(fā)病機(jī)制中的研究尚處于起步階段，本試驗(yàn)通過研究miR-142-5p對LPS引起的乳腺上皮細(xì)胞增殖、凋亡和免疫應(yīng)答的影響，探討miR-142-5p對乳腺炎的影響，為臨床上研究奶牛乳腺炎的防治新策略提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基和TRIzol?Reagent，均購自美國英杰生命技術(shù)有限公司；小鼠miR-142-5p模擬物(Mimics)、抑制劑(Inhibitors)和相應(yīng)的陰性對照小分子RNA，均購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；細(xì)胞因子ELISA檢測試劑盒，購自武漢新啟迪生物科技有限公司；細(xì)胞凋亡試劑盒和EdU試劑盒，均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；羊抗兔AKT、p-AKT、P65、p-P65、GAPDH和HRP標(biāo)記山羊抗家兔IgG抗體，均購自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司；細(xì)胞核蛋白與總蛋白提取試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒，均購自北京博邁德科技發(fā)展有限公司；ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒，購自安諾倫(北京)生物科技有限公司。

1.2 主要儀器 UV755B型分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；光學(xué)顯微鏡，日本奧林巴斯公司產(chǎn)品；MIKRO-22R型高速冷凍離心機(jī)，德國赫提馳公司產(chǎn)品；垂直板電泳槽和半干轉(zhuǎn)印儀，美國伯樂公司產(chǎn)品；流式細(xì)胞儀，美國BD生物科學(xué)公司產(chǎn)品。

1.3 細(xì)胞來源 小鼠乳腺上皮細(xì)胞系(EpH4-Ev)，購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(American Type Culture Collection,ATCC)。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)及處理 小鼠乳腺上皮細(xì)胞系置于含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，每2～3 d換液。待細(xì)胞密度達(dá)90%后用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行細(xì)胞消化和傳代。取對數(shù)生長期的細(xì)胞，待細(xì)胞融合至80%～90%時(shí)，接種到6孔板中，完全貼壁后換液，將細(xì)胞分為6個(gè)組，分別是對照組(Control,CON)、脂多糖組(LPS)、脂多糖+抑制劑陰性對照組(LPS+inhibitors NC)、脂多糖+抑制劑組(LPS+inhibitors)、脂多糖+模擬物陰性對照組(LPS+mimics NC)和脂多糖+模擬物組(LPS+mimics)，每組設(shè)6個(gè)重復(fù)孔(n=6)，對應(yīng)組別細(xì)胞中加入抑制劑或模擬物繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，加入LPS(10 μg/mL)共培養(yǎng)2 h，收集樣品進(jìn)行后續(xù)檢測。

1.4.2 ELISA檢測細(xì)胞因子表達(dá) 收集細(xì)胞上清液，采用ELISA方法檢測腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor α,TNF-α)、白細(xì)胞介素6(Interleukin 6,IL-6)、白細(xì)胞介素1β(Interleukin 1β,IL-1β)和白細(xì)胞介素8(Interleukin 8,IL-8)表達(dá)水平，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡 胰酶消化并收集細(xì)胞，PBS洗滌后，分別進(jìn)行細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的檢測。細(xì)胞周期檢測：收集的細(xì)胞于預(yù)冷的70%乙醇中4 ℃固定4 h，離心重懸細(xì)胞，用RNase A和PI溶液對細(xì)胞進(jìn)行染色，混勻，室溫下避光孵育30 min，利用細(xì)胞內(nèi)DNA能與PI結(jié)合的特性，通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞各個(gè)時(shí)期的DNA含量，重復(fù)3次。細(xì)胞凋亡檢測：細(xì)胞加入Annexin V-FITC混勻，室溫下避光孵育15 min，上機(jī)前5 min再加入PI溶液，1 h內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

1.4.4 EdU法檢測細(xì)胞增殖活力 具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。細(xì)胞接種于24孔板，每孔加入10 μmol/L EdU溶液，37 ℃孵育4 h后去除培養(yǎng)液，PBS洗滌。4%多聚甲醛室溫固定15 min，清洗，0.3% TritonX-100通透15 min，按照試劑盒說明書配置Click反應(yīng)液，37 ℃避光孵育30 min。Hoechst避光復(fù)染細(xì)胞核5 min，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞增殖活力。

1.4.5 Western blot檢測蛋白表達(dá) 提取細(xì)胞的總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取20 μg總蛋白經(jīng)12% SDS-PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入GAPDH、AKT、p-AKT、P56、p-P56一抗(1∶1 000稀釋)，4 ℃搖床中孵育過夜。次日TBST充分洗滌，經(jīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，充分洗滌，用ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒顯色。以GAPDH 為內(nèi)參，經(jīng)凝膠圖像分析系統(tǒng)對條帶進(jìn)行光密度測定并分析，以目的蛋白和內(nèi)參條帶的光密度比值代表相應(yīng)蛋白的相對表達(dá)水平。試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.5 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)”表示，采用SPSS 19.0中ANOVA程序?qū)υ囼?yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析和Duncan氏多重比較，以P<0.05(差異顯著)作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 miR-142-5p對細(xì)胞因子表達(dá)的影響 與對照組比較，LPS組TNF-α(圖1A)、IL-6(圖1B)、IL-1β(圖1C)、IL-8(圖1D)的分泌水平均顯著升高(P<0.05)；與LPS組相比，LPS+inhibitors組顯著抑制LPS誘導(dǎo)的上述上調(diào)作用(P<0.05)，LPS+mimics組上述上調(diào)作用進(jìn)一步增強(qiáng)(P<0.05)，LPS+inhibitors NC組和LPS+mimics NC組差異均不顯著(P>0.05)。

圖1 乳腺上皮細(xì)胞炎性因子的變化

2.2 miR-142-5p對AKT和P65蛋白磷酸化水平的影響 如圖2所示，與對照組比較，LPS組p-AKT和p-P65蛋白相對表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05)；與LPS組相比，LPS+inhibitors組上述上調(diào)作用被顯著抑制(P<0.05)，而LPS+mimics組上調(diào)作用顯著增強(qiáng)(P<0.05),LPS+inhibitors NC組和LPS+mimics NC組則差異均不顯著(P>0.05)。

圖2 乳腺上皮細(xì)胞AKT、P65及其磷酸化水平的變化

2.3 miR-142-5p對小鼠乳腺上皮細(xì)胞細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖的影響 與對照組相比(圖3A)，LPS組G0/G1期細(xì)胞比率上升(圖3B)，LPS+mimics組G0/G1期細(xì)胞比率進(jìn)一步上升(圖3F)。同時(shí)，與對照組相比，LPS組S期細(xì)胞比率下降(圖3B)，LPS+mimics組下降更明顯(圖3F)。細(xì)胞增殖檢測結(jié)果顯示，與對照組相比(圖4A)，LPS組乳腺上皮細(xì)胞的增殖活力受到抑制(圖4B)；與LPS組相比，LPS+mimics組抑制效果更明顯(圖4F)。說明miR-142-5p過表達(dá)可抑制細(xì)胞S期DNA合成過程，導(dǎo)致乳腺上皮細(xì)胞周期被阻滯在G0/G1期，抑制細(xì)胞增殖。

圖3 miR-142-5p對乳腺上皮細(xì)胞細(xì)胞周期的影響

圖4 miR-142-5p對乳腺上皮細(xì)胞細(xì)胞增殖活力的影響

2.4 miR-142-5p對小鼠乳腺上皮細(xì)胞細(xì)胞凋亡的影響 為驗(yàn)證miR-142-5p在調(diào)節(jié)LPS誘導(dǎo)的乳腺上皮細(xì)胞凋亡進(jìn)程中的作用，本試驗(yàn)檢測了細(xì)胞凋亡率。如圖5所示，與對照組相比，LPS組乳腺上皮細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與LPS組相比，LPS+inhibitors組細(xì)胞凋亡率顯著下調(diào)(P<0.05)，LPS+mimics組細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步升高(P<0.05)，LPS+inhibitors NC組和LPS+mimics NC組差異均不顯著(P>0.05)。說明miR-142-5p在LPS誘導(dǎo)的乳腺上皮細(xì)胞的凋亡中起促進(jìn)作用。

3 討論

miRNAs是一類內(nèi)源性的，長度為18～24個(gè)核苷酸的小RNA，廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)，具有高度的保守性。miRNAs參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種生命活動(dòng)，在疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了重要的作用。研究證實(shí)，炎癥刺激后miR-142在骨骼、肺等器官中均有表達(dá)，其在炎癥的發(fā)生與發(fā)展過程中具有重要的調(diào)節(jié)作用[16,17]。急性肺損傷小鼠支氣管肺泡灌洗液和外周血中miR-142的表達(dá)均顯著增加，LPS誘導(dǎo)的急性腎損傷大鼠系膜細(xì)胞中miR-142-3p的表達(dá)亦上調(diào)[18]。關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)滑液中miR-142的表達(dá)水平與炎癥持續(xù)的時(shí)間相關(guān)，提示其參與了炎癥預(yù)后，與滑膜組織的增生和修復(fù)密切相關(guān)[19]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)LPS處理的乳腺上皮細(xì)胞中miR-142-5p的表達(dá)上調(diào)，且miR-142-5p 模擬物能促進(jìn)NF-κB通路的激活，并進(jìn)一步上調(diào)LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞因子的表達(dá)，該結(jié)果與Sun等的研究結(jié)果一致[20]，表明miR-142-5p可能在乳腺炎中起到促炎作用。

本試驗(yàn)進(jìn)一步研究了LPS和miR-142-5p對小鼠乳腺上皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響。結(jié)果顯示，LPS處理后細(xì)胞阻滯于G0/G1期，經(jīng)miR-142-5p模擬物處理后細(xì)胞周期的阻滯效果顯著提高，miR-142-5p模擬物抑制劑處理對阻滯效果則有所緩解，表明miR-142-5p能抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而凋亡的上皮細(xì)胞降解會(huì)誘導(dǎo)有毒物質(zhì)和促炎性物質(zhì)的分泌。

本試驗(yàn)也存在一些局限性，1個(gè)miRNA可能有多個(gè)靶點(diǎn)，1個(gè)基因可能有多個(gè)miRNAs靶點(diǎn)，因此本結(jié)果有待在體內(nèi)進(jìn)一步證實(shí)。體外試驗(yàn)結(jié)果表明，miR-142-5p可能通過調(diào)節(jié)炎性因子的釋放分泌以及細(xì)胞的增殖和凋亡在乳腺炎中發(fā)揮促炎作用，該結(jié)果為臨床上乳腺炎的防治提供了一種新的思路。