陳 睿，周 躍，廖振蕓，王威威，李宜海，韋 平，何秀苗

(1. 廣西民族大學(xué)海洋與生物技術(shù)學(xué)院 廣西多糖材料與改性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530006 ； 2. 桂林市臨桂區(qū)黃沙瑤族鄉(xiāng)水產(chǎn)畜牧獸醫(yī)站，廣西 臨桂 541113 ； 3. 桂林市臨桂區(qū)中庸鎮(zhèn)水產(chǎn)畜牧獸醫(yī)站，廣西 臨桂 541114 ；4. 廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530005)

雞傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是由傳染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)引起的雛雞急性、高度接觸性、免疫抑制性疾病[1]。IBDV主要攻擊3～6周齡雞重要的淋巴器官法氏囊(Bursa of Fabricius，BF)中未成熟的 B 淋巴細(xì)胞，造成雛雞免疫力低下進(jìn)而繼發(fā)感染其他疾病死亡，因此 IBD 被許多學(xué)者稱為“雞的艾滋病”。IBDV基因組較大的 A節(jié)段編碼1個(gè)多聚蛋白pVP2-VP4-VP3和1個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白VP5，較小的 B節(jié)段編碼 RNA 聚合酶VP1。IBDV有2個(gè)血清型，僅血清Ⅰ型病毒對雞致病，不同的血清Ⅰ型分離株在抗原性和致病性上存在差異[2]，因此將血清Ⅰ型IBDV分為超強(qiáng)毒株(vvIBDV)、經(jīng)典毒株(cIBDV)、致弱毒株(attIBDV)和變異株(vIBDV)。近年來，由于IBDVVP2基因高變區(qū)(vVP2)的快速遺傳進(jìn)化，Jackwood等[3]提出了 IBDV 的7個(gè)主要基因型類群。然而，IBDV的致病型和遺傳進(jìn)化不僅與 A 節(jié)段有關(guān)，而且還與 B 節(jié)段有關(guān)，所以一種新的基于 A、B 節(jié)段的分類方法應(yīng)運(yùn)而生[4，5]。目前，本課題組亦建立了包含中國新型變異株類群的最新分類方法[6]。

近年來，我國 IBDV 的流行出現(xiàn)了一些新的變化，如病毒基因重排和不同抗原變異株出現(xiàn)[7]、免疫雞群發(fā)病[8]和非典型病例增多等，感染雞無明顯外觀癥狀，但其中樞免疫器官法氏囊卻嚴(yán)重萎縮，免疫抑制嚴(yán)重，威脅養(yǎng)禽業(yè)健康發(fā)展[9]。本課題組最近在臨床中遇到了一起發(fā)生于黑五品種雞中的 IBD 疑似病例，該雞群在10日齡通過點(diǎn)眼滴鼻途徑同時(shí)免疫接種了新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)疫苗和FW2512中等偏強(qiáng)毒力活疫苗，雞群55日齡發(fā)病，病雞肛門粘糞，精神差，流淚，舌頭腫大，食欲下降。發(fā)病雞場共有雞只9 200羽，累計(jì)損失大約50羽。病死雞剖檢病變表現(xiàn)為法氏囊腫大、出血并有炎癥滲出物。對該病例進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)診斷，通過雞胚絨毛尿囊膜(Chorioallantoic membrane，CAM)途徑接種進(jìn)行病毒分離鑒定，應(yīng)用 MEGA 7.0等軟件對其重要基因 A-vVP2和 B-VP1-b的分子特征進(jìn)行分析，旨在為臨床 IBD 的防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源 2019年10月，廣西桂林某雞場經(jīng)初步診斷為 IBD 的黑五品種病雞的法氏囊樣品。

1.2 主要儀器 冷凍離心機(jī)(賽默飛世爾科技公司)，PCR儀(伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司)，渦旋混合器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)，電泳儀(北京市六一儀器廠)，全自動凝膠成像儀(北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司)，生化培養(yǎng)箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)。

1.3 主要試劑 病毒RNA提取試劑 TRIzon Reagent、反轉(zhuǎn)錄試劑盒 HiFiScript cDNA Synthesis Kit和PCR試劑盒2×EsTaqMasterMix，均購自康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.4 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)已發(fā)表的經(jīng)典毒 STC 株的 A 節(jié)段全基因核苷酸序列[10]分別設(shè)計(jì)了2對針對 IBDVvVP2 的特異引物，用于vVP2 的巢式 RT-PCR 擴(kuò)增。外引物為 pts：5′-CAACAGCCAACATCAACG-3′，pta：5′-AGCTCGAAGTTGCTCACC-3′，預(yù)期擴(kuò)增片段 679 bp；內(nèi)引物為 IBDs：5′-CCCAGAGTCTACACCATA-3′，IBDa：5′-TCCTCTTGCCACTCTTTC-3′，預(yù)期擴(kuò)增片段 474 bp。根據(jù)已發(fā)表的 IBDV CEF94 株的 B 節(jié)段設(shè)計(jì)1對引物，X3：5′-CGGTGAGGATGACAAGCCC-3′(756～774 nt)；X4：5′-GGCACGATGAGTCCACCAC-3′(1 504～1 522 nt)，預(yù)期擴(kuò)增片段 767 bp[11]。引物均由大連 TaKaRa 生物工程有限公司合成，-20 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 病毒核酸檢測 參照韋平等[12]的方法進(jìn)行 IBDV 核酸檢測：采集到的法氏囊組織剪碎、研磨，加1 mL無菌 PBS 研磨制成懸液，反復(fù)凍融 3 次，3 000 r/min 離心5 min 后取上清250 μL，將上清用 Trizol 法[13]抽提總 RNA。逆轉(zhuǎn)錄體系為10 μL，42 ℃孵育50 min，85 ℃孵育5 min，即得cDNA。PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，結(jié)束反應(yīng)[14]。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，電壓80 V，電泳結(jié)果于紫外線365 nm下觀察。PCR產(chǎn)物陽性所對應(yīng)的法氏囊懸液用于進(jìn)一步的病毒分離。

1.6 病毒分離鑒定 取經(jīng)凍融、離心、過濾除菌后的法氏囊懸液上清，通過CAM途徑接種9日齡 SPF 雞胚，0.2 mL/枚，置于 37 ℃ 培養(yǎng)箱孵育，每隔 24 h 照胚觀察 1 次，棄去24 h內(nèi)死亡的雞胚，收獲24 h后死胚的尿囊液、尿囊膜和胚體，使用vVP2特異引物IBDs、IBDa通過RT-PCR進(jìn)行病毒核酸的鑒定，方法同1.5。同時(shí)擴(kuò)增分離毒株的VP1-b節(jié)段，PCR引物同1.4，PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 4 min；94 ℃ 45 s，52 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.7 分子特征分析 經(jīng)過1.6獲得的IBDVvVP2、VP1-b基因PCR產(chǎn)物送到武漢奧科鼎盛生物科技有限公司測序，使用BLAST和DNASTAR對分離株和參考毒株的vVP2序列(第206～350位氨基酸)、VP1-b序列進(jìn)行核酸序列和氨基酸序列比對，并使用MEGA 7.0 繪制遺傳進(jìn)化樹，所用參考毒株信息如下(vVP2/VP1-b)：vvIBDV：HK46(香港，AF092943/AF092944)、OKYM(日本，D49706/D49707)、MB(中國，DQ927040/DQ927041)、UK661(英國，NC004178/X92761)以及 B節(jié)段屬于HLJ-0504樣vvIBDV毒株：Harbin-1(中國，EF517528/EF517529)、HLJ-0504(中國，GQ451330/GQ451331)、NN1172(中國，MW245064/MW245065)；clIBDV：Cu-lwt (德國，AF362747/AF362748)、FW2512(中國，DQ656499/KC986359)、Faragher_52_70(法國，HG974565/HG974566)；attIBDV：Gt(中國，DQ403248/DQ403249)、Cu-1M(德國，AF362771/AF362772)、B87(中國，DQ906921/DQ906922)、CEF94(荷蘭，AF194428/AF194429)；vIBDV：Variant_E(美國，AF133904/AF133905)、9109(美國，AY462027/AY459321)、SHG358(中國，MT179721/MT179723)、SHG352(中國，MT179720/MT179722)、SHG19(中國，MN393076/MN393077)；血清Ⅱ毒株(Serotype Ⅱ IBDV)：OH(加拿大，IBU30818/IBU30819)、23_82(德國，AF362773/AF362774)。

2 結(jié)果

2.1 病毒核酸檢測 法氏囊研磨液上清提取的RNA經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄和巢式RT-PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果在474 bp 處有清晰的條帶，與預(yù)期的vVP2基因片段大小相符，表明疑似病雞的法氏囊樣品中含有 IBDV 核酸。

2.2 病毒分離鑒定 將初步檢測為IBDV核酸陽性的法氏囊懸液上清進(jìn)行無菌處理后，通過CAM途徑接種9日齡 SPF 雞胚，盲傳至第2代，雞胚在5 d內(nèi)死亡，死胚CAM增厚，胚體表現(xiàn)為全身皮下嚴(yán)重出血，尤其是頭頸部和四肢末端的出血最為嚴(yán)重(圖1)。取死胚尿囊液、尿囊膜、胚體，經(jīng)研磨、凍融處理，樣品經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增得到大小為474 bp的IBDVvVP2特異性條帶(圖2A)，vVP2經(jīng)序列測定，結(jié)果與參考IBDV序列一致；同時(shí)亦能從樣品中擴(kuò)增獲得與IBDVVP1-b片段大小相符的767 bp的目的片段(圖2B)，測序結(jié)果亦與IBDV序列相符，證實(shí)雞胚樣品中含有 IBDV，本試驗(yàn)成功分離到1株IBDV毒株，命名為 GL1906。

圖1 IBDV核酸陽性法氏囊懸液上清接種SPF雞胚病變

圖2 分離株的RT-PCR擴(kuò)增

2.3vVP2、VP1-b基因的同源性分析 基于vVP2的序列同源性分析發(fā)現(xiàn)，GL1906與國內(nèi)外參考vvIBDV如OKYM等的核苷酸和氨基酸序列同源性較高，分別為 95.6%～99.4%和96.8%～98.7%，其中與廣西前期分離株NN1172[15]的同源性最高；與參考clIBDV如Cu-1wt等的核苷酸和氨基酸序列同源性分別為90.1%～92.8% 和90.4%～94.9%，最低同源性數(shù)值出現(xiàn)在與所免疫的中等偏強(qiáng)毒株FW2512的比較中。

基于VP1-b的序列分析發(fā)現(xiàn)，GL1906與國內(nèi)外參考vvIBDV如OKYM等的核苷酸和氨基酸序列同源性分別為 87.7%～99.3% 和96.1%～99.2%，最高值出現(xiàn)在與B片段屬于獨(dú)特分支的NN1172參考株的比較中；與其他類型毒株的核苷酸和氨基酸序列同源性分別為90.2%～90.9% 和97.6%～98.8%，其中與所免疫的FW2512疫苗株的核苷酸和氨基酸序列同源性分別為90.4%和98.8%。

2.4vVP2、VP1-b基因特征性氨基酸位點(diǎn)分析 利用 DNASTAR分別對分離株GL1906的vVP2和VP1-b序列中與病毒毒力相關(guān)的特征性氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行分析，結(jié)果如表1所示，GL1906 的vVP2特征性氨基酸位點(diǎn)在第222、256、284、294、299位與 vvIBDV 參考株相同，而279N與致弱毒株相同[16]，此外，GL1906 表現(xiàn)出了與大多數(shù)參考株不同的212N。在VP1-b序列的分析上，分離株 GL1906 的242D、287A、390L、393E[17]與重排株如NN1172、HLJ-0504相同，其中242D、390L、393E的特征與弱毒株一致，287A與超強(qiáng)毒株一致。此外，分離株 GL1906的第777～782位核苷酸序列是GGTGCC，不能形成超強(qiáng)毒株所具有的KpnⅠ 酶切位點(diǎn)[18]，具有與弱毒株一致的核苷酸序列特點(diǎn)[19]。表明 GL1906 在VP1-b上既有弱毒株的分子特征，又有超強(qiáng)毒株的分子特征。

表1 IBDV A-vVP2和B-VP1-b特征性氨基酸位點(diǎn)

2.5vVP2、VP1-b基因序列系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 將分離株GL1906和疫苗株FW2512及其他參考毒株的vVP2和VP1-b序列通過 MEGA 7.0 軟件繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示，基于vVP2的分析中，所有毒株被分為2個(gè)大分支，分離株GL1906與其他血清Ⅰ型毒株同屬1個(gè)大分支，血清 Ⅱ 型23_82和OH 為另1個(gè)分支；在血清 Ⅰ 型大分支中，所有毒株又被分為4個(gè)不同的小分支，分離株 GL1906和vvIBDV參考毒株屬于A3分支，并與NN1172、HLJ-0504距離最近，與本病例所用疫苗株FW2512不在同一分支(圖3A)?；赩P1-b的分析中，所有毒株被分為3個(gè)大分支，attIBDV、cIBDV、vIBDV等同屬B1大分支；vvIBDV中的OKYM、HK46等參考株屬于B2分支，分離株GL1906與NN1172、HLJ-0504等VP1屬于特殊來源的毒株同屬B3分支(圖3B)，這一結(jié)果與VP1-b序列同源性分析及編碼的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)分析的結(jié)果基本一致。

圖3 根據(jù)IBDV vVP2 (A)和VP1-b (B)基因繪制的系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討論

廣西是我國最大的地方品種雞飼養(yǎng)產(chǎn)區(qū)，山林放養(yǎng)的飼養(yǎng)特性使得雞場生物安全措施不到位，場地很容易被污染而極易發(fā)生疾病的傳播。本病例根據(jù)發(fā)病情況、剖檢病變、病毒核酸檢測、病毒分離以及序列分析結(jié)果證實(shí)該雞群發(fā)生了IBD，并成功分離出1株基因自然重排IBDV毒株，命名為GL1906。GL1906的vVP2 和VP1-b序列分析顯示，GL1906 在vVP2 序列同源性、關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)和遺傳進(jìn)化分析上均具有 vvIBDV 的特征；而在基于VP1-b的分析中，GL1906VP1-b在特征氨基酸位點(diǎn)上既有弱毒株的特征，又有強(qiáng)毒株的特征，系統(tǒng)進(jìn)化樹中與參考株HLJ-0504和NN1172處于同一分支，而HLJ-0504與NN1172的VP1-b已被證實(shí)具有獨(dú)特來源[20,21]，不屬于其他參考株，表明分離株GL1906的vVP2 和VP1-b片段具有不同的來源。He等[8]研究表明，vVP2 和VP1-b可分別代表IBDV 基因組A、B節(jié)段進(jìn)行分子特征分析，并具有流行病學(xué)意義，鑒于以上分析結(jié)果，GL1906為基因自然重排病毒，且根據(jù)課題組建立的基因型分類方法[6]，GL1906是基因型為A3B3的毒株。

值得注意的是，GL1906與NN1172和HLJ-0504具有高度的相似性，眾所周知，自1979年中國首次報(bào)道IBD病例以來，vvIBDV在中國流行并廣泛傳播，其中，HLJ-0504株成為所有雞群的顯性基因型，因此推測HLJ-0504類似株將成為臨床診斷中的優(yōu)勢毒株。同時(shí)，GL1906分離株具有與近年分離株類似的vVP2基因的D212N突變和相似的VP1-b基因，但不同的是，GL1906 在vVP2關(guān)鍵位點(diǎn)第279位發(fā)生了由 D(vvIBDV)變?yōu)镹(致弱毒株)的突變，研究表明，VP2序列是毒力和細(xì)胞趨向性的主要決定因素[22]，VP2 蛋白的第279位(D→N)突變是IBDV適應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)所必須的重要氨基酸位點(diǎn)之一[23]，GL1906 D279N的變化預(yù)示著該分離株有能適應(yīng)體外細(xì)胞培養(yǎng)的潛質(zhì)。NN1172是本課題組2011年田間分離毒株，已經(jīng)成為課題組試驗(yàn)的模式毒株，而本次分離的GL1906有望成為下一個(gè)模式毒株。同時(shí)SWSASGS 七肽區(qū)的保守性以及 279D 和 284A 這2個(gè)特征氨基酸是強(qiáng)毒株的重要標(biāo)志[24]，第279位的突變可能會改變毒株抗原性[25]和致病力[26]，具體影響有待于進(jìn)一步研究。IBDV的致病性與2個(gè)基因組片段(片段A和片段B)都有關(guān)，A-vv/B-att重排毒株通常導(dǎo)致病毒致病性降低[27]，A-att/B-vv重排株往往表現(xiàn)出更高的致病性[28]，而研究發(fā)現(xiàn)A-vv/B-HLJ-0504 like的重排使IBDV仍然保持著高毒力，代表著一種超強(qiáng)毒力的表型，而GL1906正是A-vv/B-HLJ-0504 like表型，因此推測本病例分離株GL1906可能具有較強(qiáng)的致病力，從而引起感染雞發(fā)病死亡。

本病例雞群于10日齡通過點(diǎn)眼滴鼻途徑同時(shí)免疫接種過新支二聯(lián)苗和FW2512活疫苗，55日齡發(fā)生IBD，結(jié)合分離株GL1906的分子特征分析發(fā)病原因如下：第一，不同疫苗同時(shí)經(jīng)過同一途徑免疫，可能造成雞群免疫不均勻致部分雞免疫失敗。本病例養(yǎng)雞場飼養(yǎng)量大，但損失的雞只不多的現(xiàn)象極有可能是這個(gè)原因，因此建議養(yǎng)雞場加強(qiáng)對雞群體內(nèi)抗體水平的監(jiān)測，制定合理有效的免疫方案，適時(shí)調(diào)整免疫程序；第二，中等偏強(qiáng)毒力的活疫苗致使法氏囊損傷，活疫苗具有模仿被IBDV感染的優(yōu)點(diǎn)，能誘導(dǎo)有效的細(xì)胞和體液免疫，但活疫苗具有通過抗原性漂移的方式發(fā)生變異和使法氏囊萎縮的缺點(diǎn)[29]，造成雞群的免疫抑制而易于被野毒感染；第三，雞場在使用活疫苗免疫后，消毒不徹底，造成場地污染而使疫苗株在雞體內(nèi)循環(huán)感染，同時(shí)又遭受野毒感染，2種不同毒力的病毒混合感染雞群，給病毒基因重排創(chuàng)造了機(jī)會，毒力不斷改變而形成新的感染源所致[11]；第四，雞群感染的 IBDV 野毒株突破了疫苗的保護(hù)從而使雞群發(fā)病。該雞群感染的 GL1906在基因組雙節(jié)段重要氨基酸位點(diǎn)上均表現(xiàn)既具有超強(qiáng)毒株的特征，又具有弱毒株的特征，并在vVP2上具有與國內(nèi)近十幾年的分離株所普遍具有的D212N改變[30]，該突變被認(rèn)為可能與毒株抗原性發(fā)生漂變有關(guān)。此外，GL1906VP2的D279N可能使該毒株VP2蛋白構(gòu)象發(fā)生一些改變，從而突破抗體保護(hù)引起感染。

本病例分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)前 IBD 仍對廣西地區(qū)的養(yǎng)雞業(yè)存在威脅，強(qiáng)毒株依然是流行毒株，特征性氨基酸位點(diǎn) D279N使毒株可適應(yīng)細(xì)胞，有望用于后續(xù)細(xì)胞感染試驗(yàn)。IBDV易變異，對環(huán)境有較強(qiáng)的抵抗力，新毒株不斷被發(fā)現(xiàn)，目前傳統(tǒng)疫苗免疫的保護(hù)效果不再理想，本課題組也已分離出新型變異株[31]，預(yù)示著 IBD 的防控面臨著新挑戰(zhàn)，因此持續(xù)跟蹤和分離流行株，掌握病原進(jìn)化規(guī)律對于指導(dǎo)廣西地區(qū) IBD 的防控具有重要的意義。