關(guān)文碧 ，楊曉靜，鄭嵋丹，朱國榕

1. 肇慶學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院（肇慶 526061）；2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（肇慶）（肇慶 526061）

在我國環(huán)境激素類農(nóng)藥優(yōu)先名錄中[1]，三唑醇是除活體試驗(yàn)以外的試驗(yàn)數(shù)據(jù)證明具有內(nèi)分泌干擾作用的農(nóng)藥，吡蟲啉、腈菌唑、丙環(huán)唑和戊唑醇是美國環(huán)保局經(jīng)4個(gè)暴露途徑篩選出的農(nóng)藥品種。2018年珠江流域監(jiān)測顯示吡蟲啉的檢出率為98.6%，最大檢出質(zhì)量濃度為162 ng/L[2]。2019年江蘇太湖水樣監(jiān)測顯示[3]，戊唑醇檢出率為97%，最高檢出質(zhì)量濃度為2 040 ng/L；三唑醇檢出率為100%，質(zhì)量濃度為11～15 ng/L。2020～2021年間河北白洋淀中丙環(huán)唑的監(jiān)測質(zhì)量濃度為3.84～1 209 ng/L[4]。沈陽污水處理廠的進(jìn)水和出水中均檢出腈菌唑，質(zhì)量濃度在1.5～5 μg/L范圍內(nèi)[5]。為保護(hù)人類健康，美國規(guī)定魚、軟體動(dòng)物中吡蟲啉的限量值為50 μg/kg[6]，日本規(guī)定上述5種農(nóng)藥在水產(chǎn)品中執(zhí)行0.01 mg/kg的限量標(biāo)準(zhǔn)[7]。而我國尚未對水產(chǎn)品中腈菌唑、丙環(huán)唑、三唑醇、戊唑醇和吡蟲啉制定最大殘留限量要求。

試驗(yàn)選擇高選擇性、高靈敏度的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）技術(shù)，基于高效、價(jià)廉的分散固相萃取法，建立LC-MS/MS快速檢測水產(chǎn)品中5種環(huán)境激素類農(nóng)藥的殘留分析方法，并在廣東省內(nèi)采集市售60份魚、蝦和螺樣品進(jìn)行檢測，為水產(chǎn)品中環(huán)境激素類農(nóng)藥殘留風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

腈菌唑標(biāo)準(zhǔn)溶液100 mg/L、丙環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)溶液100 mg/L、三唑醇標(biāo)準(zhǔn)溶液100 mg/L、吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)溶液1 000 mg/L（阿爾塔科技有限公司）；戊唑醇標(biāo)準(zhǔn)溶液100 mg/L（北京海岸鴻蒙標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)公司）；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、乙酸乙酯（分析純）、甲酸（分析純）、乙酸（分析純）：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；氯化鈉、無水硫酸鈉（均為分析純，西隴科學(xué)股份有限公司）；PSA固相萃取填料、C18固相萃取填料（直徑40～60 μm，天津博納艾杰爾科技有限公司）；γ相納米氧化鋁（直徑10 nm，南京先豐納米材料科技有限公司）；弗羅里硅土（0.075 0～0.150 mm孔徑，即100～200目）、中性氧化鋁（0.048 0～0.075 0 mm孔徑，即200～300目）：上海阿拉丁生化科技有限公司。

Waters Xevo TQD液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Waters公司）；Centrisartg-16C高速冷凍離心機(jī)、Secura?分析天平（德國Sartorius公司）；Multi Reax全能型振蕩器（德國Heidolph海道夫）；Thermo μV-TOC超純水系統(tǒng)（美國Thermo公司）；KQ-25ODE數(shù)控超聲波清洗器（江蘇昆山市超聲儀器公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 溶液配制

分別量取1.0 mL腈菌唑/丙環(huán)唑/戊唑醇/三唑醇標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 mg/L）和100 μL吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000 mg/L）于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配得10 mg/L 5種農(nóng)藥的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。量取1 mL甲酸和1 mL乙酸分別加入100 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度線，搖勻，配得1.0%甲酸乙腈和1.0%乙酸乙腈。

1.2.2 樣品前處理

分別取蝦、魚、貝可食用部分，用高速攪拌機(jī)充分?jǐn)囁楹笾糜?18 ℃冰箱中避光保存，使用前常溫解凍。稱取2 g魚、蝦及貝類樣品于50 mL塑料離心管中，加入10 mL乙腈，振蕩提取20 min，加入2 g氯化鈉和2 g無水硫酸鈉，渦旋30 s，在4 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min，取上清液過0.22 μm有機(jī)濾膜，待測。

1.2.3 色譜條件

1.2.3.1 HPLC條件

色譜柱ACQUITU UPLC? HSS T3（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；柱溫25 ℃；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量5.0 μL；流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液和乙腈；洗脫方式采用梯度洗脫。洗脫程序：0～1.0 min，乙腈由10%上升至90%，1.0～3.0 min，乙腈保持90%，3.0～3.5 min，乙腈下降至10%，3.5～5 min乙腈保持10%。

1.2.3.2 質(zhì)譜條件

離子化模式ESI+；質(zhì)譜掃描方式采用多反應(yīng)監(jiān)測；干燥氣流量600 ℃；干燥溫度200 ℃；離子傳輸管溫度500 ℃；5種農(nóng)藥的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 5種農(nóng)藥的質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理方法的優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑的優(yōu)化

試驗(yàn)以蝦作為基質(zhì)，選擇甲醇、乙腈、乙酸乙酯、1%甲酸乙腈和1%乙酸乙腈5種溶劑做加標(biāo)回收試驗(yàn)，對提取溶劑的種類進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如圖1所示。用乙腈提取5種農(nóng)藥添加回收率相對較高，目標(biāo)物回收率在75%～95%，因此使用乙腈作為提取劑。

圖1 提取溶劑對蝦中農(nóng)藥回收率的影響

2.1.2 提取方法優(yōu)化

不同提取方式對樣品的提取效果具有一定差異，選取蝦作為樣品基質(zhì)，比較振蕩提取20 min和超聲提取20 min這2種提取方式下目標(biāo)物的添加回收率，結(jié)果見圖2。振蕩提取的目標(biāo)物回收率比超聲提取目標(biāo)物回收率高，因此，試驗(yàn)選擇振蕩提取方式。

圖2 提取方式對蝦中農(nóng)藥回收率的影響

2.1.3 鹽析條件的優(yōu)化

試驗(yàn)對比“2 g氯化鈉+2 g無水硫酸鈉”和“2 g氯化鈉+2 g無水硫酸鎂”的鹽析效果。使用“2 g氯化鈉+2 g無水硫酸鈉”作為鹽析劑，5種農(nóng)藥回收率為75.7%～91.8%，SRSD為3.38%～7.59%。使用“2 g氯化鈉+2 g無水硫酸鎂”作為鹽析劑，5種農(nóng)藥回收率為69.3%～114.2%，CV為4.11%～11.21%。所以試驗(yàn)選用“2 g氯化鈉+2 g無水硫酸鈉”作為鹽析劑。

2.1.4 凈化條件的優(yōu)化

試驗(yàn)分別以50 mg PSA、50 mg C18、50 mg 10 nm氧化鋁、50 mg弗羅里硅土和50 mg中性氧化鋁作為凈化劑，以及不加凈化劑6個(gè)條件進(jìn)行凈化效果的對比。不同凈化條件下蝦中農(nóng)藥添加回收試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。使用等量的PSA、C18、納米氧化鋁、弗羅里硅土和中性氧化鋁時(shí)，吡蟲啉添加回收率分別為67.1%，61.3%，66.6%，59.4%和66.7%。不使用凈化劑時(shí)，吡蟲啉回收率為78.2%。凈化劑的使用會(huì)導(dǎo)致吡蟲啉的添加回收率下降。同時(shí)，使用C18作為凈化劑會(huì)使丙環(huán)唑和戊唑醇下降到66.4%和69.6%。此外，對比不同凈化條件下目標(biāo)物的基質(zhì)效應(yīng)?；?.2.2的樣品前處理方法，分別以50 mg PSA、50 mg 10 nm氧化鋁、50 mg弗羅里硅土和50 mg中性氧化鋁作為凈化劑對1 mL空白蝦樣品提取溶液進(jìn)行凈化及不加凈化劑凈化，得到不同凈化條件下蝦的空白樣品溶液，用以稀釋10 mg/L的5種農(nóng)藥的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制5.0～200 μg/L的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液和溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液。按照式（1）計(jì)算農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果如表2所示。無凈化和加入不同凈化劑對目標(biāo)農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)影響不大。因此，在滿足回收率的要求并兼顧節(jié)省經(jīng)濟(jì)成本、簡化提取步驟的前提下，試驗(yàn)選擇省略添加凈化劑步驟，樣品經(jīng)提取、鹽析、離心后過膜直接供LC-MS/MS檢測分析。

圖3 不同凈化條件對蝦中農(nóng)藥回收率的影響

表2 不同凈化條件對農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)的影響

2.2 分析方法的確證

2.2.1 溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線、基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線和基質(zhì)效應(yīng)

按照1.2.2的樣品前處理方法制得魚、蝦、白螺的空白樣品溶液，分別以空白樣品溶液和甲醇稀釋10 mg/L的5種農(nóng)藥的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配得質(zhì)量濃度1.0，2.0，5.0，10，20，50，100和200 μg/L的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液和溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液。采用LC-MS/MS檢測，以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)，農(nóng)藥峰面積為縱坐標(biāo)，分別繪制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明，魚、蝦、螺樣品基質(zhì)中和純甲醇溶劑中5種農(nóng)藥在1～200 μg/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均有良好的線性關(guān)系，基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)（r）均在0.999 2～0.999 9范圍內(nèi)。

按照式（1）計(jì)算農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果如表3所示。

表3 5種農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)

當(dāng)基質(zhì)為蝦時(shí)，腈菌唑、丙環(huán)唑、戊唑醇無明顯的基質(zhì)效應(yīng)，三唑醇有明顯增強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)，吡蟲啉有明顯減弱的基質(zhì)效應(yīng)；當(dāng)基質(zhì)為魚時(shí)，腈菌唑無明顯基質(zhì)效應(yīng)，丙環(huán)唑、戊唑醇和三唑醇表現(xiàn)為明顯減弱的基質(zhì)效應(yīng)，吡蟲啉為明顯增強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)；當(dāng)基質(zhì)為白螺時(shí)，除三唑醇沒有明顯的基質(zhì)效應(yīng)外，其余4種均有明顯減弱的基質(zhì)效應(yīng)。

2.2.2 準(zhǔn)確度和精密度

接表4

為驗(yàn)證試驗(yàn)方法的準(zhǔn)確度和精密度，在蝦、魚、白螺3種水產(chǎn)品中進(jìn)行5，20和50 μg/kg 3個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)下的添加回收率試驗(yàn)，所得平均添加回收率和變異系數(shù)如表4所示。結(jié)果表明，5種農(nóng)藥的平均添加回收率為70.55%～107.34%，C.V.為0.73%～10.35%，符合農(nóng)藥殘留分析的要求。

表4 蝦、魚和白螺中5種農(nóng)藥的平均添加回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

2.2.3 檢出限和定量限

按照3倍信噪比判斷檢出限，10倍信噪比判斷定量限，分別得到5種農(nóng)藥的檢出限為1 μg/kg、定量限為5 μg/kg。

2.2.4 實(shí)際樣品測定

為檢驗(yàn)試驗(yàn)方法的可行性和實(shí)用性，從廣東湛江市場中隨機(jī)采購魚、蝦、螺各20個(gè)樣品進(jìn)行檢測，圖4為質(zhì)量濃度20 μg/L的蝦基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液和蝦的實(shí)際樣品的總離子流圖。60個(gè)魚、蝦、螺樣品均未檢出腈菌唑、丙環(huán)唑、戊唑醇、三唑醇和吡蟲啉5種農(nóng)藥。

圖4 質(zhì)量濃度20 μg/L的蝦基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖（A）及蝦實(shí)際樣品的總離子流圖（B）

3 結(jié)論

試驗(yàn)通過對提取溶劑、提取方式、鹽析條件、凈化條件等進(jìn)行優(yōu)化，建立LC-MS/MS快速檢測水產(chǎn)品中的腈菌唑、丙環(huán)唑、戊唑醇、三唑醇和吡蟲啉的殘留分析方法。試驗(yàn)方法靈敏度高、可靠性和實(shí)用性良好，可作為水產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留快速定量分析的一種新方法。