高慶鵬，侯亞婷，畢曉艷，劉福沖，劉平果，袁芝瓊

大理大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院（大理 671000）

線葉金雀花（AspaLathus linears）的可食部分，為南非豆科植物[Aspalathus linearis（Brum.f.）R.Dahlgren]的葉子和細(xì)莖[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，線葉金雀花含有豐富的茶多酚及類黃酮成分，植物衍生的多酚類物質(zhì)可阻止肥胖和相關(guān)脂質(zhì)代謝性疾病的發(fā)病，具有降低血脂的功能[2]。

高血脂癥（hyperLipemia，HLP），是一種脂質(zhì)代謝紊亂疾病[3]，易引發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病等疾病。由于金雀花的抗氧化功能好、安全性好及適用于多種慢性疾病的預(yù)防和調(diào)節(jié)而被廣泛關(guān)注，但對(duì)于金雀花降低血脂的研究還存在較大空白。隨著對(duì)高血脂癥的深入研究，生理生化指標(biāo)的異常成為醫(yī)學(xué)上高血脂癥的判斷標(biāo)準(zhǔn)[4]。試驗(yàn)研究3種不同濃度梯度的金雀花對(duì)高脂血癥模型小鼠TC、TG、LDL-C、HDL-C等指標(biāo)的影響，旨在揭示金雀花對(duì)高血脂癥小鼠及不同濃度梯度的暴露途徑對(duì)血脂的調(diào)節(jié)作用，并為深入研究金雀花的降血脂功能提供藥理基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

選用SPF等級(jí)的KM雄性小鼠：許可證號(hào)SYXK（滇）K2011-0004，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，體重22～26 g。試驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)環(huán)境20±3 ℃，濕度35%～70%，空氣流通，自然光照。在飼養(yǎng)過程中每天給予5 g/10 g小鼠普通飼料，每天更換飲水，每隔1 d更換墊料，定期消毒。

1.2 試驗(yàn)材料

新鮮金雀花（產(chǎn)地云南大理）；食用豬油（產(chǎn)地浙江溫州）。

1.3 試劑與儀器

99%膽固醇、亞硝酸鈉（上海麥克林生化科技有限公司）；3號(hào)膽鹽、98%丙基硫氧嘧啶、丙二醇、無水乙醇、95%蘆丁、沒食子酸分析標(biāo)準(zhǔn)品、生理鹽水（上海源葉生物科技有限公司）；吐溫-80（上海百舜生物科技有限公司）；75%乙醇（云南昆明天亙消毒制品有限公司）；無水碳酸鈉、硝酸鋁九水合物（上海羅恩化學(xué)技術(shù)有限公司）；氫氧化鈉（天津市大茂化學(xué)試劑廠）；福林標(biāo)準(zhǔn)液（海標(biāo)科技有限公司）。

0.22 μm無菌濾頭（Biosharp）；洪達(dá)醫(yī)用注射器（廣州平民藥業(yè)連鎖有限公司）；RE-3000旋蒸蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；0412-1離心機(jī)[上海醫(yī)療器械（集團(tuán)）有限公司]；723N可見分光光度計(jì)（悅豐儀器儀表有限公司）；JY5002電子天秤（上海衡平儀器儀表廠）；SK8210HP超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；SHZ-DⅢ循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀有限責(zé)任公司）；MJ-54A高壓蒸汽滅菌鍋[旋都凱儀器設(shè)備（上海）有限公司]；DZG-303A普力菲爾超純水儀（上海富詩(shī)特儀器設(shè)備有限公司）。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)文獻(xiàn)[5]，在760 nm吸收波長(zhǎng)處，以試劑空白為參比測(cè)定吸光度，吸光度為y軸，沒食子酸質(zhì)量濃度（μg/mL）為x坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸方程式為y=45.893x-0.037 6，R2=0.980 3，線性關(guān)系良好。

配制多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)試溶液：準(zhǔn)確稱取0.005 g沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)樣品，用蒸餾水溶解，定容至50 mL，得到0.1 mg/mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0和1.2 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入0.5 mL福林試劑，充分搖勻，等待1 min，加入1.5 mL 20% Na2CO3溶液，在75 ℃下反應(yīng)10 min。

1.4.2 總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)文獻(xiàn)[6]，在510 nm吸收波長(zhǎng)處，以試劑空白為參比測(cè)吸光度，以吸光度為y軸，蘆丁質(zhì)量濃度（mg/mL）為x坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸方程式為y=13.043x-0.014 6，R2=0.993 5，線性關(guān)系良好。

配制總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)試溶液：準(zhǔn)確稱取0.01 g蘆丁，75%乙醇溶解，并定容至50 mL→0.2 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液→取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5和4.0 mL→加入0.5 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，放置5 min→加入0.5 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻，放置5 min→加入5 mL 4%氫氧化鈉溶液，用75%乙醇定容至10 mL，搖勻，放置10 min。

1.4.3 樣品的測(cè)定

稱取80 g金雀花，按照一定的比例分別用乙醇溶液和水溶液浸泡1 h，使用真空抽濾裝置過濾，去渣，取300 mL上層清液，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀提取，提取完成后，取出2 mL提取液，分別量取1 mL使用分光光度計(jì)按照標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法進(jìn)行測(cè)定，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程（y=45.893x-0.037 6和y=13.043x-0.014 6）依次得出樣液中多酚和總黃酮的濃度。試驗(yàn)結(jié)果均以多酚提取率和總黃酮提取率為考察指標(biāo)[7]，按式（1）計(jì)算。

1.4.4 正交設(shè)計(jì)方案

1.4.4.1 乙醇溶液的正交試驗(yàn)

在乙醇溶液提取過程中，因存在多種單因素影響提取結(jié)果，參考單因素對(duì)結(jié)果影響，列出影響較大的單因素：乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、提取時(shí)間（B）、料液比（C）等，分別對(duì)各因素進(jìn)行考察，得出最佳的提取水平，選擇合適的單因素水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，獲得提取所需成分最佳的工藝。

根據(jù)對(duì)乙醇溶液提取法的單因素試驗(yàn)，得出影響提取結(jié)果的單個(gè)因素水平見表1。

表1 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)單因素水平表

1.4.4.2 水溶液正交試驗(yàn)

在水溶液提取過程中，同樣參考單因素對(duì)結(jié)果影響，列出影響較大的單因素：金雀花用量（A）、料液比（B）及提取時(shí)間（C），分別對(duì)各因素進(jìn)行考察，得出最佳提取水平，選擇合適的單因素水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，獲得提取所需成分最佳的工藝。

根據(jù)對(duì)水溶液提取法的單因素試驗(yàn)，得出影響提取結(jié)果的單個(gè)因素水平見表2。

表2 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)單因素水平表

1.4.5 高血脂癥模型的建立及分組

根據(jù)文獻(xiàn)[8]，高脂乳劑制作方法：25 g食品級(jí)豬油加入100 mL錐形瓶加熱融化，加入15 g膽固醇，攪拌直至溶解，再次加入2 g 3號(hào)膽鹽、1 g丙基硫氧嘧啶、20 mL吐溫、20 mL丙二醇。攪拌至充分融合，加入蒸餾水至刻度線，待溫度下降凝固，密封并在4 ℃環(huán)境中保存。每隔2 d制作1次，灌胃前水浴加溫再對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃。

第一輪造模，將小鼠隨機(jī)分為空白組和高血脂癥組，空白組14只，高血脂癥組62只?？瞻讓?duì)照組給予一定質(zhì)量的飼料，自由飲水。高脂血癥組均以0.2 mL/10 g劑量進(jìn)行灌胃，結(jié)束后給予相應(yīng)質(zhì)量的飼料，自由飲水。高脂乳劑灌胃每日1次，每隔1 d記錄體重，連續(xù)灌胃5周。

造模結(jié)束后，禁食不禁水12 h，選取空白組小鼠6只，高血脂癥組小鼠4只，進(jìn)行生理指標(biāo)的數(shù)據(jù)測(cè)定，測(cè)定其TC、TG、LDL-C、HDL-C、GLU含量，對(duì)其數(shù)據(jù)進(jìn)行SPSS的單因素分析，高血脂癥組所有指標(biāo)高于空白組，即P＜0.05時(shí)，造模成功。

試驗(yàn)階段，金雀花溶液的最佳提取方法為水溶液提取，每只小鼠的安全灌胃劑量為5 mg/kg。將高血脂癥組小鼠隨機(jī)分為5個(gè)組：高血脂組、陽性對(duì)照組、金雀花提取物（1.165 g/mL）高濃度組、金雀花提取物（0.583 g/mL）中劑量組、金雀花提取物（0.291 g/mL）低劑量組。使用不同濃度梯度的金雀花提取液進(jìn)行灌胃，每隔1 d記錄體重，連續(xù)灌胃3周。

表3 試驗(yàn)分組

1.4.6 統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)收集采用Excel 2016軟件，金雀花提取結(jié)果采用正交試驗(yàn)結(jié)果表進(jìn)行表示，小鼠各組指標(biāo)均以±s表示。分別使用SPSS 25.0軟件進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)、單因素方差分析、單因素檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水平α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交試驗(yàn)提取結(jié)果

根據(jù)乙醇溶液提取正交設(shè)計(jì)方案，結(jié)果見表4和表5。

分析表4可得，可影響金雀花中總黃酮的提取率的因素主次順序?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)（A）＞料液比（B）＞提取時(shí)間（C），金雀花中總黃酮旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀提取最佳工藝條件為A3B1C3，即乙醇體積分?jǐn)?shù)65%、料液比1∶45（g/mL）、提取時(shí)間60 min，在此條件下提取金雀花中的總黃酮提取率最高，為1.48%。

表4 正交試驗(yàn)乙醇溶液黃酮提取結(jié)果

分析表5可得，影響金雀花中多酚的提取率的因素主次順序?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)（A）＞提取時(shí)間（C）=料液比（B），金雀花中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀提取多酚的最佳工藝條件為A3B3C3，即乙醇體積分?jǐn)?shù)65%、料液比1∶55（g/mL）、提取時(shí)間60 min，在此條件下提取金雀花中的多酚提取率最高，為0.20%。

表5 正交試驗(yàn)多酚提取結(jié)果

根據(jù)水溶液提取結(jié)果可得，金雀花提取液中多酚和總黃酮的提取率與金雀花用量、提取時(shí)間呈正比，與料液比呈反比。由此，金雀花中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀提取最佳工藝條件為金雀花用量100 g、料液比1∶10（g/mL）、提取時(shí)間60 min，在此條件下金雀花中的多酚提取率為1.221%，總黃酮提取率為6.996%。

2.2 一般情況

高血脂癥模型建模5周后，選取部分小鼠進(jìn)行生理指標(biāo)檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)的數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，分析后，高血脂癥造模小鼠的血清總膽固醇F=7.239，甘油三酯F=4.425，高密度脂蛋白F=1.524，低密度脂蛋白F=8.289。空白組與之相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），即高血脂癥模型建造成功（見表6），小鼠體重變化結(jié)果見表7。

表6 部分小鼠的TC、TG、LDL-C水平（±s）單位：mmol/L

表6 部分小鼠的TC、TG、LDL-C水平（±s）單位：mmol/L

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表7 部分小鼠體重（±s）

表7 部分小鼠體重（±s）

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金雀花提取溶液灌胃3周降脂后，空白組、陽性對(duì)照組、金雀花組體重與高血脂組體重差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）?？瞻捉M與陽性對(duì)照組、金雀花各濃度組體重變化無差異，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。小鼠體重變化結(jié)果見表8。

表8 灌胃后小鼠的體重變化（±s）

表8 灌胃后小鼠的體重變化（±s）

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2.3 TC、TG、LDL-C

由表9可知，金雀花各組、陽性對(duì)照組經(jīng)方差分析，血清總膽固醇均下降，與高血脂對(duì)照組相比，其F值分別為24.02，61.26，20.70和8.23，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。0.583 g/mL金雀花組的總膽固醇水平下降率更高，TC降低水平與其余各金雀花組之間不存在明顯差異，即P＞0.05。

表9 各組小鼠的TC、TG、LDL-C水平（±s）單位：mmol/L

表9 各組小鼠的TC、TG、LDL-C水平（±s）單位：mmol/L

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金雀花各組、陽性對(duì)照組經(jīng)方差分析，甘油三酯和LDL-C均下降，與高血脂對(duì)照組相比，甘油三酯的F值分別為108.28，110.68，30.12和25.89；LDL-C的F值為168.537，187.711，140.02和99.28。差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），其中0.583 g/mL金雀花組甘油三酯水平、LDL-C水平下降率更高，更接近于陽性對(duì)照組，與其余2組金雀花組之間不存在明顯差異，即P＞0.05。

2.4 高密度脂蛋白（HDL-C）

由表10可知，陽性對(duì)照組、金雀花各濃度組其HDL-C與高血脂癥對(duì)比HDL-C均升高，其F值分別為0.063，1.144 5，0.796，1.017和0.377，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。陽性對(duì)照組升高HDL-C效果明顯更優(yōu)，但0.583 g/mL金雀花組效果接近于陽性對(duì)照組，說明抗動(dòng)脈粥樣硬化、預(yù)防冠心病的能力與其余各組相比更強(qiáng)。

表10 各組小鼠的HDL-C水平（±s） 單位：mmol/L

表10 各組小鼠的HDL-C水平（±s） 單位：mmol/L

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2.5 葡萄糖（GLU）

由表11可見，因高脂血癥極易引發(fā)其他并發(fā)癥，如糖尿病[9]，根據(jù)降脂后，金雀花各組與高脂血癥組相比，F(xiàn)值為4.602，0.649和1.444，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即（P＞0.05）。但陽性對(duì)照組與高脂血癥組經(jīng)方差分析，F(xiàn)=3.116，P＜0.05，即差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示金雀花各組雖然可使高血脂癥小鼠的葡萄糖水平下降，但是降低效果不如陽性對(duì)照組顯著。

表11 各組小鼠的GLU水平（±s） 單位：mmol/L

表11 各組小鼠的GLU水平（±s） 單位：mmol/L

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2.6 小鼠肝臟系數(shù)

表12 各組小鼠的肝臟系數(shù)（±s） 單位：%

表12 各組小鼠的肝臟系數(shù)（±s） 單位：%

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臟器指數(shù)可反映臟器的健康狀況，小鼠長(zhǎng)期接觸高脂乳劑，可導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)積累及病變，這一變化可以通過肝臟系數(shù)來反映[10]。從肝臟系數(shù)的分析來看，金雀花各組、陽性對(duì)照組與高血脂癥組對(duì)比，肝臟系數(shù)顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

3 討論與結(jié)論

試驗(yàn)表明，金雀花水提物組與高血脂模型組相比，金雀花組顯著地降低高血脂小鼠血清中的TC、TG、LDL-C含量，金雀花水提物酚酸類、黃酮類2種成分有效地影響脂肪的生成和代謝，對(duì)于降低血脂具有重要意義。

通過高脂乳劑誘導(dǎo)，高血脂組小鼠的體重、肝臟系數(shù)、葡萄糖與空白組相比顯著上升。在灌胃金雀花水提物后，小鼠的體重與肝臟系數(shù)顯著下降。由此可知，金雀花的作用機(jī)理可能在一定程度上逆轉(zhuǎn)了誘導(dǎo)的肝臟損傷，但是葡萄糖的水平雖有顯著下降，但仍未達(dá)到正常水平，其原因可能與灌胃試劑的配方、金雀花提取物的濃度有關(guān)，具體原因還有待進(jìn)一步研究。

試驗(yàn)進(jìn)行線葉金雀花的提取，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化乙醇溶液和水溶液提取方案，通過水溶液提取得到最佳提取方案，中濃度組提取物與其余濃度組相比，降低血清中的TC、TG、HDL-C和肝臟系數(shù)更為顯著，更接近陽性對(duì)照組與空白組，結(jié)果表明，中濃度組調(diào)節(jié)血脂的作用較為突出。

金雀花作為食品、藥物在調(diào)節(jié)血脂和心血管疾病方面有著可觀的前景，作為降脂藥物具有一定的安全性和優(yōu)越性，在我國(guó)的醫(yī)療保健領(lǐng)域有著探索意義，后續(xù)將對(duì)金雀花降血脂的作用機(jī)理進(jìn)行進(jìn)一步研究。