衡好，王堯，程佳怡，劉行準(zhǔn)，楊怡，郭靜靜

南京師范大學(xué)中北學(xué)院環(huán)境生物技術(shù)研究中心（丹陽(yáng) 212300）

色素具有極高的應(yīng)用價(jià)值，在醫(yī)藥、化妝品、科研染料、輕紡印染及食品等領(lǐng)域中均具有廣泛的應(yīng)用前景。天然色素是以植物、動(dòng)物及微生物等為原料，采用合適的方法可提取生物體內(nèi)細(xì)胞產(chǎn)生的色素。植物體的生長(zhǎng)受氣候、溫度等外界條件的限制較大。動(dòng)物體繁殖周期長(zhǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)條件相對(duì)苛刻，與二者相比，微生物具有種類(lèi)繁多、生長(zhǎng)繁殖速度快、培養(yǎng)工藝簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，因此是天然色素來(lái)源的首要選擇[1]。

隨著生活質(zhì)量的提高，食品安全越來(lái)越受到重視，同時(shí)食品的顏色對(duì)消費(fèi)者吸引也起著重要作用[2]。人工合成的色素工藝條件復(fù)雜、成本高、對(duì)生物毒性大，甚至有致癌風(fēng)險(xiǎn)，而天然色素?zé)o論是安全性還是色澤方面均存在著突出的優(yōu)越性。在食品工業(yè)中，天然色素常被用作著色劑和抗氧化劑等[3]。同時(shí)，許多天然色素具有良好的藥用價(jià)值，如姜黃素具有抗腫瘤、抗纖維化、腎臟保護(hù)、防治肥胖和抗炎等作用[4]。

藍(lán)色素作為三原色之一，應(yīng)用潛力巨大，然而其來(lái)源非常有限。已報(bào)道，天然藍(lán)色素多由植物中提取，產(chǎn)藍(lán)色素的微生物多局限在假單胞菌、放線(xiàn)菌、鏈霉菌及Janthinbacterium屬菌，其中在鏈霉菌中報(bào)道最多[5-7]。因此，新型產(chǎn)藍(lán)色素菌株的開(kāi)發(fā)顯得十分重要。

試驗(yàn)從江蘇省鎮(zhèn)江丹陽(yáng)市的土壤中分離篩選獲得一株產(chǎn)藍(lán)色素的微生物，對(duì)其分子生物學(xué)鑒定及菌落形態(tài)的觀(guān)察，并對(duì)色素的性質(zhì)進(jìn)行初步探究，以期為該菌株的利用奠定基礎(chǔ)及為產(chǎn)天然色素的新型菌株開(kāi)發(fā)拓寬領(lǐng)域。

1 材料與方法

1.1 土樣

采自江蘇省鎮(zhèn)江市丹陽(yáng)市。

1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基（液體，pH 7.5）：胰蛋白胨10.0 g/L、酵母粉5.0 g/L、NaCl 10.0 g/L。固體培養(yǎng)基加入2%瓊脂粉。

高氏1號(hào)培養(yǎng)基（液體，pH 7.5）：可溶性淀粉20 g/L，NaCl 0.5 g/L，KNO31.0 g/L，K2HPO4·3H2O 0.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L。固體培養(yǎng)基加入2%瓊脂粉。

以上培養(yǎng)基均需115 ℃滅菌20 min。

1.3 試驗(yàn)儀器與設(shè)備

電子天平（ALC-1100.2，Sarforius）；恒溫培養(yǎng)箱（DNP-9272，上海精宏）；超凈工作臺(tái)（CA-1390，江蘇太倉(cāng)）；pH計(jì)（SevenEasy S20，梅特勒）；臺(tái)式離心機(jī)（5145D，Eppendorf）；高壓滅菌鍋（ES-315，Tomy）；光學(xué)顯微鏡（Motic）。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 菌株的篩選

稱(chēng)取2 g土壤溶于18 mL滅菌的無(wú)菌水中，振蕩混勻后靜止30 min，取上清液稀釋至10-4，取100 μL稀釋液涂布于高氏1號(hào)固體培養(yǎng)基上，放于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，挑取產(chǎn)藍(lán)色素的菌體采用四區(qū)劃線(xiàn)的方法分離單菌落，命名為DY-1，用高氏1號(hào)液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后用50%的甘油保存菌種。

1.4.2 形態(tài)學(xué)觀(guān)察與革蘭染色

對(duì)固體培養(yǎng)基上長(zhǎng)出來(lái)的菌體觀(guān)察形態(tài)特征，高氏1號(hào)液體培養(yǎng)基長(zhǎng)出的菌體用革蘭染色，在光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察結(jié)果。

1.4.3 分子生物學(xué)鑒定

采用試劑盒獲得菌株的基因組DNA，以基因組DNA為模板經(jīng)擴(kuò)增獲得該菌株16S rRNA，送南京秉達(dá)生物科技有限公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，采用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.4.4 色素性質(zhì)的探究

采用王海勝等[8]研究中報(bào)道的方法提取色素，進(jìn)行色素性質(zhì)的分析。

1.4.4.1 色素的溶解性測(cè)定

取500 mg色素粗提物，分別放置于2 mL無(wú)水乙醇、丙酮、乙酸乙酯、甲醇、去離子水中，混合均勻，觀(guān)察顏色的變化并根據(jù)最大吸收波長(zhǎng)下的吸光度判定其溶解性。

1.4.4.2 色素吸光譜的測(cè)定

取5 g藍(lán)色素的粗提物溶解在100 mL乙醇中，制得乙醇色素溶解液。利用分光光度計(jì)在190～480 nm處作大范圍波長(zhǎng)掃描，并記錄其吸光度。

1.4.4.3 溫度對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

取等體積的乙醇色素溶解液分別置于20，30，40和50 ℃的恒溫水浴鍋中2，4，6和8 h，測(cè)定其吸光度。

1.4.4.4 pH對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

取5 mL乙醇色素溶解液，分別用1 mol/L HCl溶液和1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)至pH 5，6，7，8和9，混合均勻后靜止2，4，6和8 h，測(cè)定吸光度。

1.4.4.5 金屬離子對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

分別配制濃度為100 mmol/L的Mn2+、Mg2+、Co2+、Cu2+離子溶液，取1 mL加入9 mL乙醇色素溶解液中，混合均勻，測(cè)定0 h和放置2，4和6 h后的吸光度。

1.4.4.6 光照對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

取1 mL乙醇色素溶解液在白光下分別放置0，2，4和6 h，測(cè)定其吸光度。

1.4.5 抑菌性研究

選取大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌做抑菌性試驗(yàn)。每組取3片浸入乙醇色素提取液的直徑9 mm的小濾紙片，分別置于3種菌的涂布平板上，并各放置1個(gè)浸入無(wú)水乙醇的濾紙片進(jìn)行對(duì)照，在30 ℃培養(yǎng)24 h后觀(guān)察是否有抑菌現(xiàn)象。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)特征及革蘭染色結(jié)果

菌體與培養(yǎng)基結(jié)合較緊密，菌落凸起、邊緣整齊、表面黏稠，藍(lán)色素主要在菌落的上部，菌落背面呈乳白色（菌體形態(tài)特征見(jiàn)圖1）。100倍物鏡下觀(guān)察到藍(lán)色素呈現(xiàn)一種菱形結(jié)構(gòu)（圖2），革蘭染色顯示該菌株呈陰性（圖3）。

圖1 DY-1菌體形態(tài)

圖2 藍(lán)色素的顯微形態(tài)

圖3 DY-1革蘭染色

2.2 菌株的分子生物學(xué)鑒定

16S rRNA測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)，其與Duganella pernnlastrain FT109W和Duganella margaritaFT134W序列相似度最高，親緣關(guān)系最近，初步判斷該菌株為杜檊氏菌屬。

圖4 DY-1系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.3 色素性質(zhì)的分析

2.3.1 藍(lán)色素溶解度測(cè)定

將藍(lán)色素樣品分別加入不同的溶液中，發(fā)現(xiàn)樣品易溶于無(wú)水乙醇，微溶于去離子水，不溶于丙酮、乙酸乙酯、甲醇。

2.3.2 藍(lán)色素吸光譜的測(cè)定

如圖5所示，紫外可見(jiàn)光吸收光譜顯示該藍(lán)色素乙醇溶液在220 nm處具有最高吸收峰。

圖5 藍(lán)色素乙醇溶液190～480 nm吸收光譜圖

2.3.3 溫度對(duì)藍(lán)色素性質(zhì)的影響

將藍(lán)色素乙醇溶液分別在4個(gè)不同溫度下避光保存2，4，6和8 h，測(cè)定波長(zhǎng)220 nm處的吸光度。結(jié)果顯示（圖6），在20 ℃和30 ℃下，放置一段時(shí)間后，吸光度變化不明顯，表明該藍(lán)色素在20 ℃和30 ℃下具有一定穩(wěn)定性。而在40 ℃和50 ℃下，吸光度隨時(shí)間增長(zhǎng)而均有增加，其中50 ℃增加較明顯，由0 h的吸光度0.228增加至0.290，推測(cè)高溫可能存在一定的增色效果。

圖6 溫度對(duì)藍(lán)色素穩(wěn)定性的影響

2.3.4 光照對(duì)藍(lán)色素穩(wěn)定性的影響

如圖7所示，與0 h相比強(qiáng)光照射2，4和6 h后，色素殘存率分別為91.8%，85.7%和78.6%，表明該色素對(duì)強(qiáng)光較敏感，宜黑暗保存。

圖7 光照對(duì)藍(lán)色素穩(wěn)定性的影響

2.3.5 pH對(duì)藍(lán)色素穩(wěn)定性的影響

如圖8所示，同一時(shí)間段，酸性或者堿性條件下藍(lán)色素乙醇溶液在220 nm的吸光度與pH 7相比均有明顯增高，說(shuō)明酸和堿對(duì)藍(lán)色素有增色效果。另外，放置4 h之后，在pH 5條件下藍(lán)色素吸光度趨于平穩(wěn)，而在pH 6，8和9的條件下，藍(lán)色素吸光度均隨時(shí)間延長(zhǎng)下降明顯，表明在這些條件下長(zhǎng)時(shí)間放置會(huì)使酸堿的增色效應(yīng)有所下降。

圖8 pH對(duì)藍(lán)色素穩(wěn)定性的影響

2.3.6 金屬離子對(duì)藍(lán)色素穩(wěn)定性的影響

如圖9所示，Mn2+對(duì)藍(lán)色素增色效果顯著，6 h增色效果達(dá)到204%。Mg2+則有削減吸光度的現(xiàn)象，4 h由0.282降至0.156，降幅達(dá)到55.3%，之后趨于平穩(wěn)。Co2+和Cu2+對(duì)藍(lán)色素在短時(shí)間內(nèi)（2 h）有增色效應(yīng)，但隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)，增色效果減弱。

圖9 金屬離子對(duì)藍(lán)色素穩(wěn)定性的影響

2.4 藍(lán)色素抑菌性鑒定

1，2和3號(hào)平板分別涂布大腸桿菌、酵母菌和枯草芽孢桿菌，標(biāo)有“d”的濾紙片為乙醇對(duì)照組，其余為藍(lán)色素乙醇溶液試驗(yàn)組。由圖10可知，3個(gè)不同菌株的平板上均沒(méi)有出現(xiàn)抑菌圈，表明該藍(lán)色素對(duì)3種菌的生長(zhǎng)均沒(méi)有抑制效果。

圖10 抑菌試驗(yàn)

3 結(jié)論

在高氏一號(hào)培養(yǎng)基上篩選獲得一株產(chǎn)藍(lán)色素的微生物，經(jīng)16S rRNA測(cè)序結(jié)果，BLAST比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化的構(gòu)建，判定該微生物為杜檊氏菌屬。進(jìn)一步對(duì)色素進(jìn)行提取，結(jié)果表明該藍(lán)色素易溶于無(wú)水乙醇，最大吸收波長(zhǎng)在220 nm。強(qiáng)光、強(qiáng)酸和強(qiáng)堿對(duì)色素穩(wěn)定性影響較大，20 ℃或30 ℃下儲(chǔ)存有利于藍(lán)色素的穩(wěn)定。Mn2+對(duì)藍(lán)色素具有明顯的增色效應(yīng)，Co2+和Cu2+對(duì)藍(lán)色素的影響較小。該色素對(duì)大腸桿菌、酵母菌及枯草芽孢桿菌均沒(méi)有抑制現(xiàn)象。