王春杰，張立攀，趙夢(mèng)瑤，王俊鵬，李冰，胡桂芳

河南省商業(yè)科學(xué)研究所有限責(zé)任公司（鄭州 450000）

牡丹（Paeonia sufruticosaAndr.）為毛茛科芍藥屬植物，原產(chǎn)于我國(guó)，其顏色艷麗，被譽(yù)為“花中之王”[1]。牡丹花精油是從牡丹花瓣中提取分離出的具有芳香氣味的揮發(fā)性油狀物質(zhì)。經(jīng)研究，天然牡丹花精油具有較強(qiáng)的抗氧化、抗衰老等生理活性，可以緩解肌膚衰老、改善人體血液循環(huán)、促進(jìn)細(xì)胞再生，在化妝品、保健品、功能食品等方面有著很好的應(yīng)用前景[2-3]。2013年“丹鳳”牡丹花被批準(zhǔn)成為新食品原料[4]，前期已開展“香玉”牡丹花新食品原料申報(bào)工作；在緩解品種單一這一問題后，開發(fā)牡丹花香精產(chǎn)品，成為牡丹食品產(chǎn)業(yè)的緊迫需求。研究牡丹花精油及其提取工藝，是研發(fā)牡丹香精和化妝品的重要前提。

牡丹花精油的提取方法有多種。水蒸氣蒸餾法因其操作簡(jiǎn)便、成本較低、設(shè)備簡(jiǎn)單，是最為常見的一種精油提取方法，但其提取效率低、能耗較高，熱敏性成分在高溫下易受到破壞[5]。有機(jī)溶劑提取法具有較高的提取率，但易產(chǎn)生溶劑殘留，尤其不利于在食品領(lǐng)域的應(yīng)用[6]。超臨界二氧化碳流體萃取法（supercritical carbon dioxide fluid extraction，SFE-CO2）是借用超臨界狀態(tài)下CO2所具有的特異溶解性，對(duì)植物中的揮發(fā)性成分進(jìn)行提取，通過調(diào)節(jié)溫度和壓力使溶解在超臨界CO2中的植物精油與氣化的CO2分開，達(dá)到選擇性提取、分離化合物的目的；在提取過程中溫度較低，可有效防止熱敏組分分解，而且所得精油無溶劑殘留，是一種高效綠色的提取技術(shù)。該技術(shù)已被應(yīng)用于中藥功能活性物質(zhì)和香茅精油、迷迭香精油、玫瑰花精油、茉莉花精油等植物精油的提取[7-11]。

已有文獻(xiàn)報(bào)道SFE-CO2提取牡丹籽油的工藝研究[12-15]，但應(yīng)用于牡丹花精油的還較少。采用SFECO2法，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以精油提取率為指標(biāo)，對(duì)牡丹花精油提取工藝進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，并通過Design-Expert軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，獲得最佳工藝。通過測(cè)定牡丹花精油對(duì)DPPH自由基的清除作用，對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行研究，為牡丹花精油開發(fā)及其利用，尤其是牡丹花精油在食品和化妝品方面的運(yùn)用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牡丹花（品種為“香玉”，采摘無污染、無蟲、無病牡丹花的盛開花朵，采摘時(shí)間為上午10點(diǎn)以前、下午4點(diǎn)鐘以后，采自河南省洛陽祥和牡丹科技有限公司牡丹種植基地）；CO2（純度99.99%，河南源正特種氣體有限公司）；二苯代苦味麟自由基[DPPH，純度＞97%，梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司]；無水乙醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

Spe-edTMSFE-2型超臨界CO2提取裝置（美國(guó)應(yīng)用分離公司）；LGJ-12真空冷凍干燥機(jī)（北京松源華興科技發(fā)展有限公司）；TU-1901雙光束紫外可見光分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）；FA2004電子天平（上海衡際科學(xué)儀器有限公司）；QJ-08B粉碎機(jī)（上海兆申科技有限公司）；標(biāo)準(zhǔn)型分樣篩（上虞市五四儀器廠）；AL204-ICF分析天平（梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 牡丹花預(yù)處理

取新鮮牡丹花瓣，在真空冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行凍干處理，壓力5 Pa，溫度-35 ℃，時(shí)間15 h。凍干后的花瓣用粉碎機(jī)研碎，過篩，取0.300～0.425 mm孔徑（40～50目）干粉，作為提取原料備用。

1.2.2 超臨界CO2提取牡丹精油

稱取5 g牡丹花凍干粉（0.300～0.425 mm，即40～50目）裝入提取釜、密封，CO2氣體經(jīng)加熱加壓后通入釜中，待釜內(nèi)達(dá)到設(shè)定的溫度和壓力后，進(jìn)行連續(xù)提取，開啟提取釜出口閥門，設(shè)置CO2流量5 L/min，動(dòng)態(tài)提取一定時(shí)間后收集牡丹花精油，稱其質(zhì)量。按式（1）計(jì)算牡丹花精油提取率。

牡丹花精油提取率=牡丹花精油質(zhì)量（g）/牡丹花粉末質(zhì)量（g）×100% （1）

1.2.3 單因素試驗(yàn)

1.2.3.1 溫度對(duì)提取率的影響

采用動(dòng)態(tài)提取方式，固定壓力25 MPa、時(shí)間1.75 h、CO2流量5 L/min、收集閥溫度130 ℃，分別考察不同溫度（30，35，40，45，50和55 ℃）對(duì)牡丹花精油提取率的影響，按照1.2.2的步驟提取牡丹花精油，并計(jì)算提取率。

1.2.3.2 壓力對(duì)提取率的影響

采用動(dòng)態(tài)提取方式，固定溫度40 ℃、時(shí)間1.75 h、CO2流量5 L/min、收集閥溫度130 ℃，分別考察不同壓力（10，15，20，25，30和35 MPa）對(duì)牡丹花精油提取率的影響，按照1.2.2的步驟提取牡丹花精油，并計(jì)算提取率。

1.2.3.3 時(shí)間對(duì)提取率的影響

采用動(dòng)態(tài)提取方式，固定溫度40 ℃、壓力25 MPa、CO2流量5 L/min、收集閥溫度130 ℃，分別考察不同時(shí)間（1.75，2.00，2.25，2.50，2.75和3.00 h）對(duì)牡丹花精油提取率的影響，按照1.2.2的步驟提取牡丹花精油，并計(jì)算提取率。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，時(shí)間、壓力、溫度為自變量，設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)因素及水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平表

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取時(shí)間、溫度、壓力3個(gè)因素為自變量，以牡丹花精油提取率（Y）為響應(yīng)值，運(yùn)用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析并得到最佳提取工藝參數(shù)。每組試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.2.6 牡丹花精油對(duì)DPPH自由基清除能力測(cè)定

配制DPPH乙醇溶液：準(zhǔn)確稱取6 mg DPPH，用無水乙醇定容至250 mL，得到60 μmol/L的DPPH乙醇溶液；置于0～4 ℃避光保存，現(xiàn)配現(xiàn)用，4 h內(nèi)有效。

配制測(cè)試液：將牡丹花精油用無水乙醇進(jìn)行稀釋，分別得到質(zhì)量濃度為5.62，2.81，1.40，0.70，0.35，0.18和0.09 mg/mL的待測(cè)液。

牡丹花精油對(duì)DPPH自由基清除能力的測(cè)定，參考毛文岳等[16]的方法。準(zhǔn)確量取1 mL待測(cè)液、1 mL無水乙醇，分別與1 mL DPPH 乙醇溶液混勻，反應(yīng)30 min后，在517 nm處測(cè)定吸光度，分別記為A1和A2；量取1 mL待測(cè)液與1 mL無水乙醇混勻，反應(yīng)30 min后在517 nm 處測(cè)定吸光度A0，用無水乙醇調(diào)零，以抗壞血酸作為陽性對(duì)照，平行操作重復(fù)3次。清除率按式（2）計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 溫度的影響

由圖1可知，隨著溫度不斷升高，提取率起初呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，溫度40 ℃時(shí)達(dá)到最高。這是因?yàn)樯邷囟瓤梢约涌旆肿舆\(yùn)動(dòng)速率，提高溶質(zhì)及溶劑分子的擴(kuò)散能力，使得傳質(zhì)能力增強(qiáng)，牡丹精油溶出加快[17]。但是，溫度升高也會(huì)使超臨界CO2密度降低，溶劑化能力減小，溫度過高時(shí)，密度減小的影響更為顯著，導(dǎo)致提取率開始下降。所以溫度選擇40 ℃。

圖1 溫度對(duì)牡丹花精油提取率的影響

2.1.2 壓力的影響

由圖2可知，提取率隨著壓力的增加呈現(xiàn)先增加后降低趨勢(shì)。壓力增加使得CO2密度增加，有利于傳質(zhì)、提高提取效率。壓力過大時(shí)會(huì)導(dǎo)致超臨界CO2黏度增大，影響傳質(zhì)速率，使得精油溶解度降低，造成提取率低[18]。同時(shí)，壓力過高時(shí)對(duì)設(shè)備的要求較高，增加操作時(shí)的安全風(fēng)險(xiǎn)。所以壓力選取25 MPa。

圖2 壓力對(duì)牡丹花精油提取率的影響

2.1.3 時(shí)間的影響

由圖3可知，隨著時(shí)間的增加，提取率逐漸增大，時(shí)間達(dá)到2.5 h后，提取率隨著時(shí)間的增加而趨于穩(wěn)定。這是因?yàn)殡S著時(shí)間的延長(zhǎng)，溶質(zhì)分子在逐漸溶出的過程中逐漸達(dá)到飽和[19]。過長(zhǎng)的時(shí)間會(huì)導(dǎo)致CO2的消耗增大，成本增加，因此時(shí)間選擇2.5 h。

圖3 時(shí)間對(duì)牡丹花精油提取率的影響

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素的試驗(yàn)結(jié)果，以牡丹花精油提取率（Y）為響應(yīng)值，以溫度（A）、壓力（B）和時(shí)間（C）為響應(yīng)因素，通過Design-Expert軟件設(shè)計(jì)牡丹花精油提取工藝的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.2.2 響應(yīng)面分析

對(duì)表2結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合分析，得到模型回歸方程：Y=2.25+0.103 7A-0.021 3B+0.037 5C-0.03AB-0.007 5AC-0.092 5BC-0.092 5A2-0.092 5B2-0.105C2。對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。此模型P值為0.000 7，小于0.05，說明模型結(jié)果顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。失擬項(xiàng)P值為0.828 9，大于0.05，結(jié)果不顯著，說明該模型與試驗(yàn)結(jié)果擬合程度較好，無失擬因素。R2=0.095 29，調(diào)整決定系數(shù)Radj2=0.892 3，大于0.80，進(jìn)一步證明該模型與試驗(yàn)結(jié)果擬合程度較好，可用來對(duì)牡丹花精油SFE-CO2提取工藝進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。根據(jù)表3中F值可知，影響提取率大小的因素依次為時(shí)間（A）＞壓力（C）＞溫度（B）。此外，通過P值可知A、BC、A2、B2、C2對(duì)精油提取率有極顯著影響（P＜0.01），C對(duì)精油提取率有顯著影響（P＜0.05）。

表3 回歸模型方差分析表

為考察溫度、壓力和時(shí)間及交互作用對(duì)提取率的影響，通過Design-Expert軟件繪制任意2個(gè)因素交互作用對(duì)提取率影響的響應(yīng)面圖及等高線圖，如圖4所示。

模型的響應(yīng)曲面與等高線的形狀能夠反映因素變量對(duì)響應(yīng)值的影響和因素之間交互作用的顯著性，即曲面越陡，因素的影響越顯著；等高線圖為橢圓形且曲率越大代表兩者交互作用強(qiáng)[20]。由圖4（a和b）可知，等高線沿A軸變化比B軸、C軸都更加密集，表明時(shí)間比溫度和壓力對(duì)響應(yīng)值的影響均要大，AB、AC的交互作用都不很顯著。圖4（c）中等高線呈橢圓形，表明溫度和壓力之間的交互作對(duì)牡丹花精油的提取率影響最大，這與表3中的結(jié)果相一致。BC的F值為17.85，遠(yuǎn)高于AB和AC的F值，表明BC的交互作用影響最強(qiáng)，要大于AB、AC的交互作用。

圖4 兩因素交互作用對(duì)牡丹花精油提取率的影響

根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)分析得到最優(yōu)的超臨界CO2提取牡丹花精油的工藝條件：時(shí)間2.65 h、溫度38.1 ℃、壓力26.6 MPa。軟件預(yù)測(cè)該條件下牡丹精油提取率為2.29%。為了驗(yàn)證軟件預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性，結(jié)合實(shí)際操作，將最優(yōu)工藝條件調(diào)整為溫度38 ℃、壓力27 MPa、時(shí)間2.7 h。在最優(yōu)工藝下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，所得牡丹花精油的平均提取率為2.26%，與理論值相接近，說明該工藝條件準(zhǔn)確可靠。

2.3 牡丹花精油對(duì)DPPH自由基清除能力測(cè)定

由圖5可知，在牡丹花精油濃度在0.09～2.81 mg/mL范圍內(nèi)，隨著牡丹花精油濃度的增加，精油對(duì)DPPH自由基清除率逐漸增高，質(zhì)量濃度達(dá)到2.81 mg/mL時(shí)，DPPH自由基清除率為72.6%，隨著精油濃度繼續(xù)增加，精油對(duì)DPPH自由基清除率呈現(xiàn)逐漸穩(wěn)定趨勢(shì)。通過SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行回歸分析，得到牡丹花精油的IC50為1.783 mg/mL。相比于VC來說，牡丹花精油對(duì)DPPH自由基的清除作用較弱。

圖5 牡丹花精油對(duì)DPPH自由基的清除作用

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化超臨界CO2提取牡丹花精油的工藝條件，方差分析結(jié)果表明，影響提取率大小的因素依次為時(shí)間（A）＞壓力（C）＞溫度（B）。壓力和溫度之間具有較強(qiáng)的交互作用。結(jié)合Design-Expert軟件預(yù)測(cè)的結(jié)果及實(shí)際操作的可行性，將最終的優(yōu)化工藝定為溫度38 ℃、壓力27 MPa、時(shí)間2.7 h。超臨界CO2法提取得到的牡丹花精油具有較強(qiáng)的抗氧化活性，IC50為1.783 mg/mL。試驗(yàn)結(jié)果為牡丹花精油的生產(chǎn)、加工提供一定的理論依據(jù)，促進(jìn)牡丹的精深加工。