張柳蓮，黃清鏵，王麗寧，馬年方，梁磊，王慶福*

1. 廣東省科學(xué)院生物與醫(yī)學(xué)工程研究所，廣東省植物纖維綜合利用工程技術(shù)研究開發(fā)中心，廣東省生物質(zhì)高值化利用工程實驗室，廣州市植物纖維綜合利用重點實驗室，藥食同源功效成分研發(fā)與應(yīng)用協(xié)同創(chuàng)新中心，藥食同源崖柏精油產(chǎn)業(yè)化研究工程中心（廣州 510316）；2. 廣東省科學(xué)院（廣州 510316）

靈芝（Ganoderma lucidum）為擔(dān)子菌綱多孔菌目多孔菌科（Polyporaceae）靈芝屬（Ganoderma）[1]，古籍記載靈芝具有“善養(yǎng)心神，增智慧不忘”的功效[2]，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，靈芝具有提高免疫力[3-4]、抗腫瘤[5]、抗炎癥[6]、抗衰老[7]和抗動脈粥樣硬化[8]等方面功效，是真菌類保健食品市場的主要品種。靈芝多糖是靈芝的主要活性物質(zhì)，傳統(tǒng)的靈芝多糖提取法主要有熱水浸提法[9]、微波法[10]、超聲波法[11]等，但這些傳統(tǒng)提取方法存在提取時間長、提取率較低等缺點。利用超聲波和微波在天然產(chǎn)物提取方面的優(yōu)勢，通過單因素試驗及響應(yīng)面設(shè)計試驗，以多糖提取率為指標(biāo)，探究微波功率、超聲波功率、料液比對多糖提取率的影響，優(yōu)化靈芝子實體多糖的微波-超聲波協(xié)同提取工藝，以期為靈芝多糖高效提取提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

靈芝子實體（采用純甘蔗渣栽培所獲得子實體）；無水乙醇、苯酚、濃硫酸等（均為國產(chǎn)分析純）。

XH-300U電腦微波超聲紫外光組合催化合成儀（北京祥鵠科技發(fā)展有限公司）；PLC017臺式高速冷凍離心機（廣州市得菲科學(xué)儀器有限公司）；722G紫外可見分光光度計（上海儀電分析器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 多糖含量測定

多糖含量測定方法采用苯酚硫酸法，參照S/N 4260—2015《出口植物源食品中粗多糖的測定 苯酚-硫酸》。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：分別精密吸取0，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mL于10 mL 100 mg/L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液具塞試管中，用蒸餾水補齊至1.0 mL，加入1 mL 5%苯酚溶液，快速加入5 mL硫酸，靜置10 min后搖勻，置于30 ℃水浴中反應(yīng)20 min，在490 nm處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.723x-0.002 8，R2=0.999。

1.2.2 不同提取方法比較

微波-超聲協(xié)同波提取法：提取溫度90 ℃、提取時間20 min、料液比1∶40（g/mL）、微波功率300 W、超聲波功率500 W。熱水浸提法：提取溫度90℃、提取時間2 h、料液比1∶40（g/mL）、提取次數(shù)2次。超聲波提取法：超聲功率500 W、超聲時間40 min、料液比1∶40（g/mL）、提取次數(shù)2次。微波提取法：微波功率400 W、微波時間20 min、料液比1∶40（g/mL）、提取次數(shù)2次。提取結(jié)束后，以8 000 r/min離心10 min，提取液定容到100 mL，取5 mL濾液加入4倍體積的無水乙醇，以8 000 r/min 離心10 min，棄上清液，沉淀加5 mL水溶解，即得靈芝粗多糖提取物，備用。

1.2.3 單因素試驗

按照1.2.2的基礎(chǔ)提取參數(shù)，研究不同超聲功率、微波功率、提取時間、提取次數(shù)、提取溫度、料液比等因素條件對靈芝總多糖提取率的影響，各因素水平分別為料液比（1∶20，1∶30，1∶40，1∶50和1∶60 g/mL）、提取時間（10，20，30，40和50 min）、提取溫度（50，60，70，80和90 ℃）、超聲波功率（200，400，600，800和1 000 W）、微波功率（100，300，500，700和900 W）、提取次數(shù)（1，2，3和4次）。提取結(jié)束后，以8 000 r/min離心10 min，收集濾液備用。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化靈芝子實體多糖提取試驗

結(jié)合單因素試驗結(jié)果，應(yīng)用Box-Behnken的中心組合試驗設(shè)計原理，根據(jù)單因素試驗結(jié)果，對試驗結(jié)果影響較大的因素進行優(yōu)化試驗，分別選取超聲波功率（500，600和700 W）、微波功率（200，300和400 W）、料液比（1∶30，1∶40和1∶50 g/mL）三因素三水平設(shè)計響應(yīng)面試驗，每個自變量的低、中、高試驗水平分別以-1，0和1進行編碼，以靈芝總多糖提取率為響應(yīng)值優(yōu)化靈芝子實體多糖提取條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法比較

微波-超聲協(xié)同波提取法與超聲波提取法、熱水提取法、微波提取法相比較結(jié)果見表1。微波-超聲波協(xié)同提取法對靈芝子實體總多糖的提取率最高，為23.89 mg/g，且提取時間最短，說明該提取方法的提取效果顯著優(yōu)于其他3種提取方法。

表1 不同提取方法對靈芝子實體多糖提取率的影響

2.2 單因素試驗結(jié)果

由圖1單因素提取試驗結(jié)果可知，靈芝總多糖提取率隨著超聲波功率提高而快速升高，功率大于600 W時，繼續(xù)提高超聲波功率，總多糖提取率逐步下降，可能是由于超聲波功率過高使得部分多糖被打斷成小分子，在醇沉過程被去除，從而導(dǎo)致多糖提取率下降。微波功率100 W時，靈芝總多糖提取率較低，僅為96.98 mg/g，微波功率300 W及以上時，靈芝子實體多糖提取率趨于穩(wěn)定，多糖提取率在155 mg/g以上，這可能是由于微波功率100 W時，提取溫度難以達到設(shè)置溫度，影響提取效果。提取時間對靈芝子實體多糖提取率具有一定的影響，隨著提取時間延長，靈芝子實體多糖提取率逐步升高，提取時間超過30 min時，多糖提取率上升變慢，因此最終選擇提取時間30 min。料液比結(jié)果顯示，多糖提取率隨料液比減小先增大后降低，料液比1∶40（g/mL）時，提取率達到最高，為19.08 mg/g。隨著提取次數(shù)增加，多糖提取率逐步提升，提取次數(shù)≥2次時，提取率趨于穩(wěn)定，說明利用超聲波微波協(xié)同提取多糖提取效率高，由于提取次數(shù)對提取率影響較小，選擇提取次數(shù)2次。單因素結(jié)果顯示，微波功率、超聲波功率和料液比3個因素對多糖提取率影響較大，因此，繼續(xù)對這3個因素進行響應(yīng)面試驗優(yōu)化。

圖1 單因素試驗結(jié)果

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化提取靈芝子實體多糖結(jié)果與分析

2.3.1 響應(yīng)面優(yōu)化數(shù)據(jù)模型建立與顯著性分析

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析方法對微波-超聲波協(xié)同提取靈芝總多糖工藝進行優(yōu)化，試驗水平因素設(shè)計方案和結(jié)果見表2。利用Design-Expert 8.0.6.1軟件對表3的數(shù)據(jù)進行分析處理，并對靈芝子實體多糖提取率響應(yīng)值與超聲波功率（A）、微波功率（B）、料液比（C）3個因素進行回歸擬合，建立數(shù)學(xué)回歸模型，各因素對靈芝子實體多糖影響擬合方程為Y=24.56+0.99A+2.81B-0.32C+0.059AB+0.62AC+1.5BC-1.79A2-0.26B2-1.35C2。

表2 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗結(jié)果

表3 方差分析

靈芝子實體多糖響應(yīng)面優(yōu)化提取試驗結(jié)果如表2所示。通過方差分析可見（表3），模型具有極顯著性線性相關(guān)（P值=0.004 8＜0.01），說明試驗設(shè)計可靠。相關(guān)系數(shù)R2=0.917 6，說明響應(yīng)值的改變有91.76%來源于因素變量的改變，即實測值和預(yù)測值之間具有較高相關(guān)性，方程的擬合度較好，失擬項不顯著，所建模型可行。變化系數(shù)C.V.=5.06，說明試驗具有較高的可信度和精確度，A項（P=0.047 7＜0.05）、B項（P=0.000 2＜0.01）、A2項（P=0.016 0＜0.05）、C2項（P=0.049＜0.05）、BC項（P=0.036 5＜0.05）對響應(yīng)值的影響達到顯著水平，3個影響因素對靈芝總多糖提取率的影響依次為B＞A＞C。

2.3.2 響應(yīng)面優(yōu)化分析

通過Design-Expert 8.0.6.1軟件分析3個因素之間的交互作用對靈芝子實體多糖提取率影響，用三維響應(yīng)面曲線和二維等高線圖作為回歸方程的圖解，說明因變量和自變量之間的關(guān)系[12]，響應(yīng)面中等高圖直觀地反映出各因素交互作用對響應(yīng)值的影響，圓形表示二因素交互作用不顯著，橢圓表示二因素交互作用顯著。響應(yīng)面圖與等高線圖相對應(yīng)，響應(yīng)面圖曲面越陡峭，則該因素對響應(yīng)值的影響越顯著[13]。由圖2結(jié)果可見，料液比和微波功率對靈芝總多糖提取率的響應(yīng)面等高線顯橢圓形，曲面較陡峭，說明兩因素交互作用顯著。而料液比和超聲波功率對靈芝總多糖提取率影響的響應(yīng)面和等高圖顯近圓形，說明兩因素交互作用不顯著。靈芝子實體多糖提取率隨液體比例的增加呈先增加后減少的趨勢；提取率隨微波功率的變化逐步增加，增加幅度較??；提取率隨超聲波功率的增加先增加后減少，從試驗結(jié)果優(yōu)化得到超聲波功率為638.17 W時提取率達到最大值；料液比和超聲波功率的交互作用與微波功率和超聲波功率交互作用相比，前者對提取率的影響大于后者，通過模型計算得到最優(yōu)提取料液比1∶45.24（g/mL），微波功率400 W；為方便試驗，靈芝子實體多糖最佳提取工藝為超聲波功率638 W、微波功率400 W、料液比1∶45（g/mL）、提取溫度90 ℃、提取次數(shù)2次；利用最佳工藝提取靈芝總多糖，提取率為26.99±0.71 mg/g。

圖2 不同因素交互效應(yīng)響應(yīng)面圖

3 結(jié)論

利用響應(yīng)面試驗優(yōu)化一種基于微波-超聲輔助工藝的有效提取方法，通過方差分析表明，建立的擬合模型由二次多項式數(shù)學(xué)表示：Y=24.56+0.99A+2.81B-0.32C+0.059AB+0.62AC+1.5BC-1.79A2-0.26B2-1.35C2。模型的統(tǒng)計分析結(jié)果證實試驗值的高可靠性和準(zhǔn)確性，可用于優(yōu)化、確定最佳提取條件：超聲波功率638.17 W，料液比1∶45.24（g/mL），微波功率400 W，提取溫度90 ℃，提取次數(shù)2次，提取時間30 min。理論提取率預(yù)計為27.62 mg/g，在調(diào)節(jié)超聲波功率638 W和料液比1∶45（g/mL）條件下，提取率為26.99 mg/g，與模型預(yù)測結(jié)果相近，說明所建模型與采用的優(yōu)化方法可靠，適用于靈芝子實體多糖的提取工藝優(yōu)化和分析。