馬月瓊，陳守慧，魏新林

上海交通大學農(nóng)業(yè)與生物學院，上海食品安全工程技術研究中心（上海 200240）

聯(lián)合國預測，到2050年全球人口可達到92億。隨著人口密度的增加，食物的需求也在不斷地增加。因此，對于提高作物及農(nóng)產(chǎn)品的產(chǎn)量，需要引起全世界的重點關注，糧食產(chǎn)量增加的前提是農(nóng)業(yè)的大力發(fā)展。農(nóng)藥是保護農(nóng)作物產(chǎn)量和質(zhì)量最重要的工具。在世界范圍內(nèi)，我國是最大的農(nóng)藥產(chǎn)地，其使用量位居首位，每年產(chǎn)量可達50多萬 t，農(nóng)藥的種類約1 100種[1]，全球每年使用的化學農(nóng)藥約300萬 t[2]。有研究表明，在全球范圍內(nèi)的農(nóng)作物種植過程中，若不使用農(nóng)藥，全球農(nóng)作物總產(chǎn)量損失的10%～40%是由病蟲害造成的[3]。農(nóng)藥是一把雙刃劍：一方面，農(nóng)藥的使用具有防治病蟲害、使農(nóng)作物穩(wěn)產(chǎn)和高產(chǎn)、增加農(nóng)民收入的好處；另一方面，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，農(nóng)藥殘留是使用農(nóng)藥后必不可少的一種現(xiàn)象，亦是不能忽視的重要問題。農(nóng)藥是有毒、易殘留的化學物質(zhì)，大部分具有穩(wěn)定性較高、半衰期長[4]的特點。國家及相關部門雖然對農(nóng)藥進行管控，但事實上執(zhí)行力度尚且不夠，對于農(nóng)藥的過分依賴或者不合理使用導致農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留問題極其嚴重，自然環(huán)境也會受到嚴重污染，與此同時對人體健康和生態(tài)環(huán)境均帶來極大的危害[5]。據(jù)報道，在每年各省市場監(jiān)督管理局發(fā)布的食品抽檢報告中，其不合格食品涉及的問題主要包括農(nóng)獸藥殘留超標、食品添加劑超標、微生物污染和重金屬超標。其他國家也會因我國食品的農(nóng)藥殘留超標問題選擇拒絕進口并召回含農(nóng)殘的食品。

酶抑制法根據(jù)酶源的不同可分為動物酯酶抑制法和植物酯酶抑制法。動物酯酶一般來源于動物的腦組織和血液中[6-7]。而植物酯酶廣泛存在于各種作物中，包括小麥、玉米和不同豆類作物等。與動物酯酶相比，植物酯酶具有來源豐富、取材方便、提取步驟簡單快捷、成本低、易于保存等優(yōu)勢，因此自20世紀80年代以來，研究者開始逐漸地用植物酯酶代替動物酯酶。試驗以總酯酶活力和比活力為考核指標，對面粉、麥麩和13種植物種子中提取的植物酯酶進行篩選，選取適宜的植物酶源，并采用單因素試驗和響應面試驗結(jié)合的方法對植物酯酶的提取條件進行優(yōu)化，為植物酯酶的有效提取和深入研究花豇豆酯酶用于農(nóng)藥殘留的檢測提供參考，為尋求新的植物酯酶源提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥面粉、小麥（普洱市思茅區(qū)魏曉蘭百貨店）；玉米、紅蕓豆、花豇豆、麥麩、黑小麥、小麥仁、生白芝麻、蕎麥、蠶豆、綠豆、青豌豆、大黑豆、扁豆（河南省虞城縣興藝商貿(mào)有限公司）；α-乙酸萘酯、α-萘酚、固藍B鹽、十二烷基磺酸鈉（SDS）、丙酮（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；牛血清蛋白（分析純，上海泰坦科技股份有限公司）。

1.2 儀器與設備

TU-1810紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；Dynamica高速冷凍離心機（上海馭锘實業(yè)有限公司）；HWS-26電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司）；524G恒溫磁力攪拌器（上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司）；FW100高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；ST5000實驗室pH計（常州奧豪斯儀器有限公司）；BSA3202S電子天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 植物酯酶粗酶液的制備

將植物種子清洗干凈，曬干后粉碎3次后備用。準確稱取一定量的樣品加入到250 mL錐形瓶中，按1∶5（g/mL）的料液比加入0.1 mol/L pH 6.4的磷酸鹽緩沖液，混合均勻后，在恒溫磁力攪拌器上充分振蕩1 h，經(jīng)4層紗布過濾，將濾液倒入離心管，放于冷凍離心機中，在4 ℃條件下以8 000 r/min的速率離心10 min，收集上清液即為植物酯酶粗酶液，置于-4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 試驗方法

1.3.2.1α-萘酚標準曲線的制作[8]

配制濃度1 mmol/L的α-萘酚無水乙醇標準溶液，取8支試管，用移液槍分別準確吸取0，10，20，30，40，50，60和70 μL的α-萘酚無水乙醇標準溶液于試管中，依次加入0.1 mol/L pH 6.4的磷酸鹽緩沖液至3 mL，混合均勻，分別加入0.5 mL固藍B鹽溶液，再次充分混合后放于30 ℃恒溫水浴鍋中保溫10 min，取200 μL于96孔板中，在595 nm處測定吸光度（A595），以不加α-萘酚的溶液作空白，每組試驗重復3次。以α-萘酚標準溶液濃度為橫坐標（X），吸光度為縱坐標（Y），作圖可得最佳標準曲線，建立回歸方程，該標準曲線的斜率按式（1）計算。

式中：K為α-萘酚標準曲線的斜率；Ai為反應液在595 nm處的吸光度（A）；Ci為α-萘酚溶液濃度；n為α-萘酚標準曲線的濃度點數(shù)。

1.3.2.2 總酯酶活力的測定[9]

取10 mL試管，依次加入1.950 mL濃度0.04 mol/L、pH 6.4磷酸鹽緩沖溶液、50 μL濃度16 mmol/L的α-乙酸萘酯丙酮溶液和0.5 mL稀釋一定倍數(shù)后的酶液，充分振蕩使試管內(nèi)的溶液混合均勻，將試管放入30 ℃恒溫水浴鍋中，開始計時，反應15 min后取出試管，加入0.5 mL固藍B 鹽溶液于試管中，振蕩混勻后放入30 ℃恒溫水浴鍋中，開始計時，10 min后取出試管，用移液槍吸取200 μL于96孔板中，采用紫外可見分光光度計，在波長595 nm處測其溶液的吸光度，每組試驗重復3次。用磷酸鹽緩沖溶液作對照，根據(jù)式（2）計算總酯酶活力。

式中：E為每毫升酶液的總酯酶活力，U/mL；D為酶液的稀釋倍數(shù)；K為α-萘酚標準曲線的斜率；A595為波長在595 nm處的吸光度；V0為體系的終體積，mL；T表示反應時間，min；V1為所用酶液的體積，mL；U為酶活力單位，1 U表示在一定條件下，每分鐘分解得到1 μmolα-萘酚所需要的酶量。

1.3.2.3 蛋白含量的測定

標準曲線的制作：選用牛血清蛋白作為標準蛋白，繪制標準曲線，參照Bradford[10]的考馬斯亮藍G-250法測定蛋白質(zhì)含量。使用牛血清蛋白配制質(zhì)量濃度100 μg/mL的蛋白標準溶液，0，20，40，60和80 μg/mL的蛋白標準溶液可用100 μg/mL的蛋白標準溶液直接稀釋即可，取6支試管，每支試管加入0.1 mL BSA溶液和1 mL考馬斯亮藍G-250后，充分振蕩，在常溫條件下反應3～5 min后，取200 μL于96孔板中，在595 nm處測定吸光度A595，每組試驗重復3次。以蒸餾水作空白。以BSA質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標（X），吸光度A595為縱坐標（Y），作圖可得最佳標準曲線，建立回歸方程。

1.3.2.4 比活力的測定

比活力的測定參照文獻[11]，比活力（U/mg）按式（3）計算。

1.3.3 單因素試驗設計

1.3.3.1 料液比對酶活力的影響

將植物種子粉碎后準確稱取10 g于250 mL錐形瓶中，以0.1 mol/L pH 6.4的磷酸鹽緩沖液作為提取液，分別以1∶4，1∶5，1∶6，1∶7和1∶8（g/mL）的料液比向錐形瓶中加入磷酸鹽緩沖液對花豇豆酯酶進行提取，混合均勻后，在恒溫磁力攪拌器上充分攪拌1 h，經(jīng)4層紗布過濾，將濾液倒入離心管，放于冷凍離心機中，在4 ℃條件下以8 000 r/min的速率離心10 min，收集粗酶液，按照1.3.2.2的方法對總酯酶活力進行測定。

1.3.3.2 提取液pH對酶活力的影響

配制濃度為0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液，pH分別為6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5和9.0。將植物種子粉碎后準確稱取10 g于250 mL錐形瓶中，按料液比1∶5（g/mL）向錐形瓶中分別加入以上不同pH的磷酸鹽緩沖液對花豇豆酯酶進行提取，混合均勻后，在恒溫磁力攪拌器上充分攪拌1 h，再經(jīng)4層紗布過濾，將濾液倒入離心管，然后放于冷凍離心機中，在4 ℃條件下以8 000 r/min的速度離心10 min，收集粗酶液，按照1.3.2.2的方法對總酯酶活力進行測定。

1.3.3.3 浸提時間對酶活力的影響

將植物種子粉碎后準確稱取10 g于250 mL錐形瓶中，按料液比1∶5（g/mL）加入0.1 mol/L pH 6.4的磷酸鹽緩沖液，混合均勻后，在恒溫磁力攪拌器上分別攪拌0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，12.0和18 h后，經(jīng)4層紗布過濾，將濾液倒入離心管，放于冷凍離心機中，在4 ℃條件下以8 000 r/min的速度離心10 min，收集粗酶液，按照1.3.2.2的方法對總酯酶活力進行測定。

1.3.3.4 離心速率對酶活力的影響

將植物種子粉碎后準確稱取10 g于250 mL錐形瓶中，按料液比1∶5（g/mL）加入0.1 mol/L pH 6.4的磷酸鹽緩沖液，混合均勻后，在恒溫磁力攪拌器上充分攪拌1 h，經(jīng)4層紗布過濾，將濾液倒入離心管，放于冷凍離心機中，在4 ℃條件下，離心速率設置為2 000，4 000，6 000，8 000，10 000和12 000 r/min，離心10 min后，收集粗酶液，按照1.3.2.2的方法對總酯酶活力進行測定。

1.3.4 Box-Behnken試驗設計

在單因素試驗的基礎上，確定各因素的最佳水平范圍，采用響應面中心組合試驗設計，研究各參數(shù)對酯酶總活力的影響規(guī)律，并得到最佳提取條件。以料液比（A）、提取液pH（B）、浸提時間（C）和離心速率（D）為自變量，酶活力作為響應值，其因素水平編碼見表1。

表1 響應面試驗因子水平及編碼

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0數(shù)據(jù)分析軟件對數(shù)據(jù)進行顯著性分析。使用Origin 8.5軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析并繪制圖表，采用Design-Expert 11進行響應面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 α-萘酚及蛋白質(zhì)含量的標準曲線

α-乙酸萘酯經(jīng)植物酯酶催化水解產(chǎn)生α-萘酚和乙酸，α-萘酚和顯色劑固藍B鹽發(fā)生反應，生成紫紅色的偶氮化合物和鹽酸。如圖1所示，以α-萘酚標準溶液濃度為橫坐標（X），吸光度為縱坐標（Y），繪制得到的α-萘酚標準曲線圖，斜率為K，結(jié)合α-萘酚含量的標準曲線和總酯酶活力的計算公式就可以計算出相應植物酯酶的總活力。α-萘酚標準曲線的相關系數(shù)為0.996 63，線性關系表現(xiàn)良好。

圖1 α-萘酚的標準曲線

根據(jù)植物酯酶的比活力計算公式，需測定總蛋白含量。試驗采用考馬斯亮藍G-250法測定蛋白質(zhì)含量，牛血清蛋白作為標準蛋白，繪制得到的標準曲線如圖2所示，相關系數(shù)為0.997 55，具有良好的線性關系，符合試驗使用。

圖2 蛋白質(zhì)的標準曲線

2.2 不同植物酶源總酯酶活力和比活力的比較

試驗選取的酶源材料有面粉、麥麩及13種植物種子，測定并比較其總酯酶活力和比活力，結(jié)果如圖3所示。通過方差分析，結(jié)果顯示植物酯酶廣泛存在于面粉、麥麩和其他13種植物種子中。由此可以看出花豇豆酯酶的總酯酶活力和比活力極顯著高于其他14種植物酯酶，花豇豆的總酯酶活力是面粉的21.718倍、蠶豆的30.644倍。其比活力是面粉的5.587倍、蠶豆的27.379倍。其中，玉米的總酯酶活力最小，蠶豆酯酶的比活力最小。綜合考慮，試驗選擇花豇豆作為最佳植物酯酶酶源。

圖3 不同植物酶源

2.3 單因素試驗結(jié)果與分析

2.3.1 料液比對酶活力的影響

比較不同料液比對于花豇豆酯酶提取效果的影響，由圖4可知，隨著料液比從1∶4（g/mL）到1∶8（g/mL）的變化，即提取液用量不斷增加，相當于對花豇豆酯酶的稀釋倍數(shù)不斷增大，總酯酶活力呈現(xiàn)先增大后持續(xù)降低再上升的變化趨勢，料液比1∶5（g/mL）時，總酯酶活力達到最大值，提取效果最佳。由此可以判斷，料液比太低時，花豇豆酯酶不能充分地溶解于提取液中，從而導致提取不完全，總酯酶活力會偏低，繼續(xù)增加提取液用量，花豇豆酯酶的總酶活力會隨之增大，料液比超過1∶5（g/mL）時，提取液用量過多會導致酯酶量減少，并且料液比過大會產(chǎn)生試劑和能源的浪費。因此，綜合考慮，最佳料液比為1∶5（g/mL）。

圖4 料液比對花豇豆酯酶總活力的影響

2.3.2 提取液pH對酶活力的影響

對比pH 6.0～9.0的范圍內(nèi)對花豇豆酯酶提取的效果。不同提取液pH對總活力的影響如圖5所示。隨著提取液pH增大，花豇豆酯酶的總活力先呈現(xiàn)升高的趨勢。pH 8.0時，總活力達到最大值。繼續(xù)提高pH，總酯酶活力呈現(xiàn)下降趨勢。在酸性或強堿性條件下，酶的構象和穩(wěn)定性均會受到較大影響，易造成酶蛋白的變形或聚集等，從而使得酶的活性減弱。因此，提取液最佳pH為8.0。

圖5 提取液pH對花豇豆酯酶總活力的影響

2.3.3 浸提時間對酶活力的影響

在0.5～18 h的浸提時間范圍內(nèi)進行花豇豆酯酶提取效果的比較。不同浸提時間對總活力的影響如圖6所示。提取時間小于2 h時，隨著浸提時間延長，花豇豆的總酯酶活力也在不斷增大。超過2 h后，花豇豆的總酯酶活力先下降到達最低值后又開始上升。但浸提時間過長，再加后續(xù)酯酶的分離純化導致時間成本太高，因此，綜合考慮，選擇合適的浸提時間使得酯酶充分溶出即可，故選取2 h作為花豇豆酯酶的最佳浸提時間。

圖6 浸提時間對花豇豆酯酶總活力的影響

2.3.4 離心速率對酶活力的影響

在2 000～12 000 r/min的離心速率范圍內(nèi)進行花豇豆酯酶提取效果的比較。不同離心速率對總活力的影響如圖7所示。離心速率在6 000～10 000 r/min的范圍內(nèi)，花豇豆酯酶的總酯酶活力具有極顯著的變化。轉(zhuǎn)速小于8 000 r/min時，提高轉(zhuǎn)速，酯酶總活力相應地提高。轉(zhuǎn)速大于8 000 r/min時，提高轉(zhuǎn)速，酯酶總活力又出現(xiàn)下降趨勢。因此，選取8 000 r/min作為花豇豆酯酶的最佳離心速率。

圖7 離心速率對花豇豆酯酶總活力的影響

2.4 響應面試驗結(jié)果與分析

2.4.1 模型建立與數(shù)據(jù)分析

基于單因素試驗的分析結(jié)果，根據(jù)Box-Benhnken中心組合設計四因素三水平的響應面分析試驗，試驗方案根據(jù)表1的因子與水平設計，利用Design-Expert 11軟件將試驗結(jié)果進行二次多項式回歸擬合，試驗結(jié)果見表2。

表2 響應面優(yōu)化試驗設計及結(jié)果

得到花豇豆酯酶總活力對料液比（A）、提取液pH（B）、浸提時間（C）和離心速率（D）的二次多項式回歸方程：酶活力=-10.09+0.369 7A+0.180 9B+0.254 1C+0.222 4D+0.105 1AB-0.228 7AC-0.071 2AD+0.269 7BC-0.071 2BD-0.143 9CD-1.74A2-1.27B2-2.88C2-0.823 4D2。回歸模型方差分析見表3。

應用方差分析對模型的顯著性進行評價，響應值酶活力的方差分析結(jié)果如表3所示。在模型的建立過程中，若出現(xiàn)影響不顯著的項會直接刪除，P值反映模型中每一項的顯著性，P＜0.01說明影響極顯著，P＜0.05說明影響顯著，P＞0.05說明影響不顯著。該模型中的A、B、C、D、AC、BC、CD均為極顯著，說明試驗因素對酶活力不是簡單的線性關系，方程回歸顯著。

模型F=2 086.27，P＜0.000 1，表明建立的模型具有極高的有效性。方程失擬項（Lack of fit）F=3.64，P=0.112 2＞0.05，不顯著，說明該模型沒有失擬現(xiàn)象，模型合適。由表3可知，花豇豆酯酶提取效果的顯著性大小順序為A＞C＞D＞B，即料液比＞浸提時間＞離心速率＞提取液pH。該模型的R2=0.999 5，Radj2=0.999 0，兩者非常接近，預測值和試驗值高度相關，說明該模型能夠解釋99.90%的響應值變化，模型擬合的效果較好。

表3 試驗結(jié)果的方差分析及顯著性檢查

接表3

2.4.2 響應面分析

等高線的形狀可以直觀地反映出兩因素交互作用對花豇豆酯酶活力影響的大小，圓形表明交互作用不顯著，橢圓形表明交互作用顯著。根據(jù)對所模型的分析結(jié)果可知，主要影響花豇豆酯酶酶活的因素是料液比（A）和浸提時間（C）。圖8顯示料液比和浸提時間對花豇豆酯酶酶活交互作用的結(jié)果，可以直觀看出兩者交互作用顯著。

圖8 料液比和浸提時間交互作用的響應面及等高線圖

2.4.3 驗證試驗

根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗所得的結(jié)果和多項式回歸方程，可以得到花豇豆酯酶的最佳提取工藝條件：料液比1∶5.326（g/mL）、提取液pH 8.138、浸提時間2.434 h、離心速率7 648.768 r/min。該條件下酶活力的預測值為9.515 U/mL。結(jié)合實際操作的可行性，將提取工藝條件調(diào)整為料液比1∶5（g/mL）、提取液pH 8、浸提時間2 h、離心速率8 000 r/min。在此條件下進行3次驗證性試驗，酶活力的實際值為9.081 U/mL，非常接近預測值，說明該模型可靠性較高，可以較好地預測花豇豆酯酶的實際酶活。

3 結(jié)論

根據(jù)對玉米、麥麩、生白芝麻、黑小麥、蠶豆、蕎麥、面粉、小麥、小麥仁、大黑豆、青豌豆、扁豆、紅蕓豆、綠豆和花豇豆中提取的植物酯酶的總酶活力和比活力的比較，得出花豇豆為最佳植物酶源。以單因素試驗的結(jié)果為基礎，用響應面法對花豇豆酯酶的提取條件進行優(yōu)化，建立料液比、提取液pH、浸提時間和離心速率對酶活力二次回歸方程模型。經(jīng)驗證，模型的可靠性較高，可較好地預測花豇豆酯酶的實際酶活。結(jié)合單因素試驗、響應面試驗和驗證試驗，確定植物酯酶最佳提取條件：料液比1∶5（g/mL）、提取液pH 8、浸提時間2 h、離心速率8 000 r/min。在此最佳提取條件下酶活力為9.081 U/mL，與預測值較為接近。