夏文俊，于斐，胡鵬遠(yuǎn)，張曉旭，張燕，包亮亮，毛宏凱，瑪依沙·達(dá)肯，曹明芹

新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，烏魯木齊 830011

肺癌是世界范圍內(nèi)高發(fā)的惡性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計，全球每年約有220萬新發(fā)肺癌病例，179萬人死于肺癌［1］。結(jié)核病是一種由結(jié)核分枝桿菌引起的以呼吸系統(tǒng)為主的慢性傳染病，以肺部感染為主，?？衫奂岸嗵幤鞴偌敖M織［2］。在臨床中，肺癌患者早期癥狀不明顯，易與肺結(jié)核等其他肺部疾病混淆，常導(dǎo)致許多肺癌患者確診時已為中晚期，錯過了最佳治療時機(jī)［3-4］。因此，早期鑒別診斷肺癌與具有相似臨床癥狀和放射學(xué)特征的肺結(jié)核患者，對于提高肺癌患者的生存率、結(jié)核病患者治愈率和降低整體疾病負(fù)擔(dān)是十分必要的。2022年3月—10月，本研究通過生物信息信息學(xué)方法篩選肺癌與肺結(jié)核的差異表達(dá)基因（DEGs），并利用機(jī)器學(xué)習(xí)算法構(gòu)建肺癌與肺結(jié)核的鑒別診斷模型，以期為早期肺癌與肺結(jié)核患者的診斷提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 肺癌與肺結(jié)核DEGs篩選 以lung cancer、tuberculosis等關(guān)鍵詞對GEO公共數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）進(jìn)行檢索，按照以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選：①數(shù)據(jù)集需具有肺癌和肺結(jié)核患者樣本；②微陣列數(shù)據(jù)；③符合美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）要求的權(quán)威機(jī)構(gòu)檢測。篩選獲得GSE42834數(shù)據(jù)集，其中包含35例肺結(jié)核樣本，16例肺癌樣本，共20 912個基因。運(yùn)用R軟件limma包的經(jīng)驗貝葉斯聯(lián)合線性模型篩選GSE42834數(shù)據(jù)集中肺癌與肺結(jié)核DEGs。為了避免可能因線性分析而造成的假陽性結(jié)果，使用Benjamin and Hochberg（BH）法將P值調(diào)整為錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）。篩選條件為FDR＜0.05且|log2FC|＞1.5。

1.2 肺癌與肺結(jié)核DEGs的GO生物過程與KEGG作用通路分析 運(yùn)用R軟件clusterProfiler包對GSE42834數(shù)據(jù)集中肺癌與肺結(jié)核DEGs進(jìn)行GO生物過程及KEGG作用通路富集分析，篩選排名前20的GO生物過程及KEGG作用通路富集結(jié)果，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.3 肺癌與肺結(jié)核核心DEGs篩選 將獲得的前100個肺癌與肺結(jié)核DEGs輸入STRING工具（https：//string-db.org），物種選擇Human，置信度選擇medium confidence（0.4），構(gòu)建蛋白—蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）。運(yùn)用Cytoscape軟件進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)的圖形化，使用CytoHubba插件篩選連接度前10的基因作為肺癌與肺結(jié)核核心DEGs。采用t檢驗分析核心DEGs在肺癌與肺結(jié)核患者的表達(dá)情況。

1.4 肺癌與肺結(jié)核鑒別診斷模型構(gòu)建及評價 將篩選出的肺癌與肺結(jié)核核心DEGs輸入R軟件caret包，使用留一交叉驗證法（LOOCV）結(jié)合8種機(jī)器學(xué)習(xí)算法構(gòu)建肺癌與肺結(jié)核的鑒別診斷模型，包括支持向量機(jī)（SVM）、自適應(yīng)提升算法（AdaBoost）、C5.0決策樹（C5.0）、隨機(jī)森林（RF）、樸素貝葉斯（NB）、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（NN）、線性判別分析（LDA）及邏輯回歸（LR）模型，篩選模型的最優(yōu)參數(shù)。使用Bootstrap法對模型進(jìn)行內(nèi)部驗證，采用準(zhǔn)確率、Kappa值、敏感度及特異度來初步評價鑒別診斷模型的診斷準(zhǔn)確度。

2 結(jié)果

2.1 肺癌與肺結(jié)核DEGs篩選結(jié)果 GSE42834數(shù)據(jù)集中共篩選出肺癌與肺結(jié)核DEGs 325個，包含205個上調(diào)基因和120個下調(diào)基因。見OSID碼圖1。

2.2 肺癌與肺結(jié)核DEGs的GO生物過程與KEGG作用通路分析結(jié)果 GO生物過程分析結(jié)果顯示，肺癌與肺結(jié)核DEGs主要富集的生物過程為對病毒的反應(yīng)、對病毒的防御反應(yīng)、干擾素γ（HFN-Y）反應(yīng)等；KEGG作用通路分析結(jié)果顯示，肺癌與肺結(jié)核DEGs主要富集的作用通路為甲型流感、EB病毒感染、抗原處理和呈遞等。見OSID碼圖2。

2.3 肺癌與肺結(jié)核核心DEGs篩選結(jié)果 PPI網(wǎng)絡(luò)中顯示200個節(jié)點，516個邊緣（OSID碼圖3）。利用CytoHubba插件獲得具有最高連通性的前10個核心DEGs，分別為STAT1、CXCL10、MX1、ISG15、IFIH1、OASL、IFIT3、GBP1、IFI44和 IFIT1（OSID 碼圖4）。經(jīng)驗證，10個關(guān)鍵基因在肺癌患者中的表達(dá)水平均低于肺結(jié)核患者（P均＜0.05）。見OSID碼圖5。

2.4 肺癌與肺結(jié)核鑒別診斷模型構(gòu)建及評價結(jié)果 將10個肺癌與肺結(jié)核核心DEGs納入8種算法建立肺癌與肺結(jié)核鑒別診斷模型，模型的最優(yōu)參數(shù)見表1。內(nèi)部驗證結(jié)果顯示，所有鑒別診斷模型準(zhǔn)確率、Kappa值、靈敏度及特異度均較高，其中Ada-Boost、RF、NN和LR準(zhǔn)確率為1.000。見表2。

表1 肺癌與肺結(jié)核鑒別診斷模型的最優(yōu)參數(shù)

表2 肺癌與肺結(jié)核鑒別診斷模型評價結(jié)果

3 討論

肺癌與肺結(jié)核均屬于呼吸系統(tǒng)常見疾病，且肺結(jié)核是肺癌發(fā)病的危險因素之一［5］。目前，臨床中對肺癌與肺結(jié)核患者的鑒別診斷方法主要是穿刺活檢和影像學(xué)檢查。肺部穿刺活檢屬于侵入性檢查，且需要檢查者具有較高的操作水平才能保證結(jié)果的準(zhǔn)確性［6］；影像學(xué)檢查常用于肺部空洞形成后，無法對肺癌與結(jié)核病進(jìn)行早期的篩查與診斷。因此，探索有效且切實可行的診斷生物標(biāo)志物及鑒別診斷模型對區(qū)分早期肺癌與肺結(jié)核患者具有重要意義。

本研究通過GSE42834數(shù)據(jù)集中肺癌與肺結(jié)核患者的轉(zhuǎn)錄特征來識別肺癌和肺結(jié)核的DEGs，共獲得325個DEGs。GO生物過程和KEGG作用通路分析顯示，這些DEGs主要富集于病毒反應(yīng)、病毒防御反應(yīng)、IFN-γ反應(yīng)等生物學(xué)過程，涉及甲型流感、EB病毒感染、抗原處理和呈遞等作用通路。通過構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)獲得了肺癌與肺結(jié)核核心DEGs，分別為STAT1、CXCL10、MX1、ISG15、IFIH1、OASL、IFIT3、GBP1、IFI44和IFIT1。

STAT1是STAT蛋白家族的成員，具有激活I(lǐng)FN/STAT1通路和抗結(jié)核分枝桿菌的作用。IFN/STAT1通路是介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞與宿主微環(huán)境成分之間的典型信號通路，通過激活I(lǐng)FN-γ發(fā)揮其抗腫瘤活性［7］。如果STAT1低表達(dá)可能抑制IFN-γ激活，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲［8］；YI等［9］研究發(fā)現(xiàn)，人體內(nèi)高水平的磷酸化STAT1可以產(chǎn)生抗結(jié)核作用，提示STAT1可能是鑒別診斷肺癌與肺結(jié)核患者的重要標(biāo)志物之一。CXCL10屬于CXC趨化因子，與CXCR3受體結(jié)合后可以促進(jìn)單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞聚集到病變部位，從而發(fā)揮細(xì)胞免疫作用。有研究發(fā)現(xiàn)，肺癌患者KDM4C基因的異常高表達(dá)會導(dǎo)致CXCL10啟動子區(qū)域活化的組蛋白H3K36me3富集，從而抑制CXCL10的表達(dá)［10］；FAN等［11］研究發(fā)現(xiàn)，活動性肺結(jié)核患者CXCL10水平顯著增高，CXCL10是結(jié)核病的重要標(biāo)志物之一。這提示CXCL10在肺癌與肺結(jié)核中均異常表達(dá)，可能在肺癌與肺結(jié)核的鑒別診斷中發(fā)揮重要作用。GBP1是GTP酶超家族的成員，在正常細(xì)胞中具有抗增殖作用，在炎癥條件下可抑制早期血管生成。GBP1的表達(dá)具有高度背景依賴性，低表達(dá)時會促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移［12］；高表達(dá)時會抑制Caspase-3的激活，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞凋亡減少，促進(jìn)分枝桿菌在細(xì)胞內(nèi)的生存和感染的建立［13］。因此，GBP1也可能是鑒別肺癌與肺結(jié)核患者的重要標(biāo)志物。MX1、ISG15、IFIH1、OASL、IFIT3、IFI44、IFIT1均是IFN響應(yīng)基因靶標(biāo)，具有誘導(dǎo)IFN反應(yīng)、產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)因子和炎癥細(xì)胞因子的作用。該類基因高度表達(dá)可能意味著IFN先天反應(yīng)的激活，因此具有區(qū)分肺結(jié)核與肺癌的潛力。

近年來，機(jī)器學(xué)習(xí)結(jié)合生物信息學(xué)方法憑借其較高的準(zhǔn)確率，在疾病診斷研究中得到越來越多的應(yīng)用。HAMMAD等［14］通過基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫建立結(jié)直腸癌診斷模型；NING等［15］通過10個miRNA使用SVM算法建立前列腺癌診斷模型。本研究基于10個肺癌與肺結(jié)核核心DEGs，應(yīng)用多種機(jī)器學(xué)習(xí)算法構(gòu)建肺癌與肺結(jié)核的鑒別診斷模型，內(nèi)部驗證結(jié)果發(fā)現(xiàn)均具有較高的準(zhǔn)確性，所有診斷模型的準(zhǔn)確率均大于0.900且Kappa值、靈敏度及特異度均較高，其中AdaBoost、RF、NN和LR的準(zhǔn)確率為1.000，提示模型具備較好的診斷分類能力。

綜上所述，本研究通過機(jī)器學(xué)習(xí)算法結(jié)合生物信息學(xué)方法建立了8個肺癌與肺結(jié)核早期鑒別診斷模型，其中AdaBoost、RF、NN和LR準(zhǔn)確性較高，可為肺癌與肺結(jié)核的早期鑒別診斷提供參考。但如果將這些關(guān)鍵基因應(yīng)用于臨床實踐中，還需要在更多的外部獨立數(shù)據(jù)集進(jìn)行驗證。在下一步研究中，我們將引入新的肺癌與肺結(jié)核患者進(jìn)行模型效果的外部評價，并對核心基因在肺癌與肺結(jié)核中的生物學(xué)功能與機(jī)制做進(jìn)一步研究。