沈蓉 陳淼

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，且有發(fā)病率逐年升高和年輕化的趨勢。盡管早期發(fā)現(xiàn)和放療可以顯著降低乳腺癌的病死率，但是乳腺癌的高轉(zhuǎn)移性和高擴(kuò)散性使患者的預(yù)后較差[1，2]。環(huán)狀 RNA CDR1as 和miR-483-5p 是一類非編碼RNA，不僅參與細(xì)胞的增殖、遷移和凋亡，還參與先天免疫等，而且在多種疾病的發(fā)病中起著至關(guān)重要的作用[3，4]。Ren 等[5]證實miR-483-5p 基因在乳腺腫瘤組織和正常乳腺組織中的表達(dá)存在差異，miR-483-5p 在正常組織中的表達(dá)水平較低，但是其與乳腺癌的關(guān)系以及是否可以作為乳腺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因子尚不清楚?；诖耍狙芯客ㄟ^探討乳腺癌組織中環(huán)狀RNA CDR1as 及miR-483-5p 表達(dá)特點，分析其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料選取2020年1月～2021年3月我院50 例乳腺癌患者的病理腫瘤樣本作為實驗組，配對的癌旁3cm 正常乳腺組織樣本作為對照組。本研究經(jīng)過我院倫理委員會批準(zhǔn)，并在患者知情同意的情況下使用臨床樣本，記錄患者生存情況以及臨床病理學(xué)資料，包括患者的TNM 分期、腫瘤分化程度、年齡、腫瘤大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等，同時對患者進(jìn)行術(shù)后隨訪。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①組織樣本總長度超過1.5cm；②樣本符合診斷標(biāo)準(zhǔn)和免疫處理，且不屬于疑難病例；③所有樣本均經(jīng)病理學(xué)證實，患者術(shù)前未接受過任何治療，且無其他惡性病史；④臨床資料保存完整，收集的組織凍存于液氮中。排除標(biāo)準(zhǔn)：①樣本來源患者不同意該實驗措施且未簽訂知情同意書；②未經(jīng)倫理委員會批準(zhǔn)同意的樣本。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器 原位雜交檢測試劑盒（MK1030，武漢博士德公司）；寡核苷酸探針稀釋液（武漢博士德公司）；DEPC（Sigma 公司，美國）；DAB 顯色試劑盒（北京中杉公司）。HT-1 組織芯片制備儀（遼寧恒泰公司）。環(huán)狀RNA CDR1as 正向引物：5′-GAAA ATCCACATCTTCCAGACAA-3′，反向引物：5′-GAAG ACATGGATATTGAGCCAGT-3′。miR-483-5p 正向引物：5′-TAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3′，反向引物：5′-TCACCTTCACCGTTCCAGTTT-3′。

1.2.2 組織芯片制備 采用定位儀對典型部位進(jìn)行標(biāo)記，并進(jìn)行 HE 染色。在每個樣品中選取3 個基因位點，利用HT-1 組織芯片制備機(jī)制造芯片，以1mm 為中心，以4μm 為基準(zhǔn)，連續(xù)切片，然后進(jìn)行HE 染色。

1.2.3 原位分子雜交 嚴(yán)格按原位雜交試驗試劑盒中的說明書進(jìn)行。具體操作步驟：將探針滴入薄片，按1:400 的比例，42℃恒溫雜交16h。用37℃溫水浴對抗體進(jìn)行1h 的免疫反應(yīng)，然后用 DAB 顯色儀對其進(jìn)行染色。將其與建立的陽性組織作對照，建立一個負(fù)對照：用探針稀釋法代替探針。

1.3 觀察指標(biāo)①對所收集到的染色強(qiáng)度進(jìn)行半定量的綜合評價。陽性染色：乳腺上皮及細(xì)胞胞質(zhì)均有顯著的黃褐色。染色強(qiáng)度等級：弱或不帶顏色為1 分，中度染色為2 分，強(qiáng)染色為3 分。陽性細(xì)胞計數(shù)：＜10%的細(xì)胞計數(shù)為1 分；10%～50%的細(xì)胞計數(shù)為2 分；＞50%的細(xì)胞計數(shù)為3 分。染色強(qiáng)度分?jǐn)?shù)乘以陽性細(xì)胞計數(shù)分?jǐn)?shù)為最終的統(tǒng)計分?jǐn)?shù)，＞3分表示強(qiáng)陽性（高表達(dá)），1～3 分表示弱陽性（低表達(dá)）。②采用門診、電話或微信的方式隨訪記錄50例患者1年生存率及預(yù)后，患者死亡視為預(yù)后不良。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0 統(tǒng)計學(xué)軟件分析，計量資料用±s描述，行t檢驗；計數(shù)資料用百分率描述，行χ2檢驗。生存分析采用Kaplan-Meier 分析，相關(guān)變量通過Logistic 回歸方程分析，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組環(huán)狀RNA CDR1as 及miR-483-5p 表達(dá)水平比較實驗組環(huán)狀RNA CDR1as 表達(dá)水平高于對照組，miR-483-5p 表達(dá)水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

1 兩組環(huán)狀RNA CDR1as 及miR-483-5p 表達(dá)水平比較（±s）

1 兩組環(huán)狀RNA CDR1as 及miR-483-5p 表達(dá)水平比較（±s）

分組n環(huán)狀RNA CDR1asmiR-483-5p實驗組501.24±0.522.31±0.41對照組500.70±0.534.37±0.48 t 5.14223.193 P 0.0000.000

2.2 影響環(huán)狀RNA CDR1as 及miR-483-5p 在乳腺癌組織中表達(dá)水平的單因素分析飲食、體重和遺傳對環(huán)狀RNA CDR1as 及miR-483-5p 在乳腺癌組織中表達(dá)水平影響較小。腫瘤大小、TNM 分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響環(huán)狀RNA CDR1as 及miR-483-5p在乳腺癌組織中表達(dá)水平的重要因素（P＜0.05），見表2。

表2 單因素分析

2.3 多因素分析多因素分析結(jié)果顯示，腫瘤＞5cm、TNM 分期為Ⅲ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性是影響環(huán)狀RNA CDR1as 及miR-483-5p 在乳腺癌組織中表達(dá)水平的重要因素（P＜0.05），見表3。

表3 多因素分析

2.4 乳腺癌患者1年生存率及預(yù)后50 例乳腺癌患者中RNA CDR1as 高表達(dá)、miR-483-5p 低表達(dá)共13例，死亡7 例，生存率為46.15%；兩者均低表達(dá)37例，死亡5 例，生存率為86.49%；Kaplan-Meier 分析顯示環(huán)狀RNA CDR1as 高表達(dá)、miR-483-5p 低表達(dá)是患者預(yù)后不良的危險因素（Log Rank Cox=5.307，P=0.021）。

3 討論

隨著腫瘤分子技術(shù)的發(fā)展和臨床經(jīng)驗的積累，乳腺癌的治療手段也在不斷改進(jìn)，但更高水平的早期診斷及高?；颊咦R別，是先進(jìn)治療手段發(fā)揮作用的前提。腫瘤的發(fā)生是由多個基因共同作用的，因此，利用分子生物技術(shù)可以為腫瘤的診斷和預(yù)測提供更好的方法，從而為腫瘤的治療提供依據(jù)[6]。miR-483-5p 是一種內(nèi)源性非編碼RNA，其長度為22 個核苷酸，能直接切斷目標(biāo)mRNA，或與目標(biāo)mRNA 的3′末端互補或不完全互補，從而阻斷靶基因的mRNA 轉(zhuǎn)錄，在生命活動中起關(guān)鍵作用，甚至參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[7]。環(huán)狀RNA CDR1as 是一類非編碼RNA，其作用機(jī)制主要是利用海綿對微小RNA 進(jìn)行吸收。研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀RNA CDR1as 在很多實體腫瘤中均異常表達(dá)，而環(huán)狀RNA CDR1as的異常表達(dá)可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移[8]。劉曉康等[9]研究發(fā)現(xiàn)，miR-483-5p 可通過調(diào)節(jié)腎上腺皮質(zhì)癌下游的基因家族成員而抑制其侵襲性，表明miR-483-5p 可能是一種惡性腫瘤早期診斷和預(yù)后指標(biāo)。有研究表明，miR-483-5p 以及環(huán)狀RNA CDR1as 可作為一種新的腫瘤診斷及預(yù)后指標(biāo)[10]，然而，miR-483-5p 以及環(huán)狀RNA CDR1as 在乳腺癌發(fā)病過程中的作用機(jī)制尚不清楚。

本研究通過檢測50 例乳腺癌患者的癌組織和50 例癌旁正常組織中環(huán)狀RNA CDR1as 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)癌組織中環(huán)狀RNA CDR1as 表達(dá)水平明顯高于正常組織，miR-483-5p 表達(dá)水平低于正常組織，為進(jìn)一步證實miR-483-5p 以及環(huán)狀RNA CDR1as 在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用提供了依據(jù)。張俊峰等[11]研究表明，miR-483-5p 基因的表達(dá)增加，對腫瘤細(xì)胞 EMT 有抑制作用，從而抑制了腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移。為進(jìn)一步證實miR-483-5p 以及環(huán)狀RNA CDR1as 在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用，本研究分析了環(huán)狀RNA CDR1as 及miR-483-5p 表達(dá)水平與患者預(yù)后的相關(guān)性，結(jié)果顯示環(huán)狀RNA CDR1as 高表達(dá)及miR-483-5p 低表達(dá)的乳腺癌患者生存率低，環(huán)狀RNA CDR1as 高表達(dá)、miR-483-5p 低表達(dá)是乳腺癌患者預(yù)后不良的危險因素（P＜0.05），分析其可能原因為：環(huán)狀RNA CDR1as 的過度表達(dá)能促進(jìn)腫瘤的生長，而CDR1as 的表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。抑制環(huán)狀RNA CDR1as對腫瘤細(xì)胞的浸潤、轉(zhuǎn)移有顯著的抑制作用，并能促進(jìn)其凋亡，進(jìn)而影響患者腫瘤分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況。Ulsh?fer 等[12]研究也表明，環(huán)狀RNA CDR1as 在癌組織中表達(dá)增高，并與腫瘤的大小、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后有關(guān)。此外，RNA 沉默引起的環(huán)狀RNA CDR1as 高表達(dá)，可通過調(diào)節(jié)miR-7的表達(dá)，降低 REG-γ 基因的表達(dá)，增加了對抗藥性乳腺癌的抗藥性，進(jìn)而影響患者預(yù)后。miR-483-5p 是一種具有潛在抑癌作用的miRNA，可抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。Rahmati 等[13]利用在線生物信息技術(shù)對miR-483-5p 進(jìn)行了初步探索，證實DAPK1 為miR-483-5p 的直接靶向靶點，通過miR-483-5p 靶向DAPK1 抑制DAPK1 作用，進(jìn)而降低乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，并證實miR-483-5p在乳腺癌患者中高表達(dá)與其預(yù)后相關(guān)。表明miR-483-5p 有望作為一種新的乳腺癌治療生物目標(biāo)，為乳腺癌患者提供新的療法[14]。

本研究顯示，環(huán)狀RNA CDR1as 及miR-483-5p 在乳腺癌組織中表達(dá)水平與腫瘤＞5cm、TNM 分期Ⅲ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性相關(guān)，但其具體影響機(jī)制有待于更多的研究證實。與正常乳腺組織比較，乳腺癌組織中環(huán)狀RNA CDR1as 的表達(dá)升高。環(huán)狀RNA CDR1as 基因的表達(dá)與其臨床病理特點之間具有相關(guān)性。Belter 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀RNA CDR1as 在癌組織中的表達(dá)水平明顯增高，而環(huán)狀RNA CDR1as 通過調(diào)節(jié)細(xì)胞基因，誘導(dǎo)其腫瘤細(xì)胞增殖分化，可能解釋了環(huán)狀RNA CDR1as 以及miR-483-5p 在乳腺癌組織中的表達(dá)水平與腫瘤＞5cm、TNM 分期Ⅲ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性間的關(guān)系。

綜上所述，乳腺癌組織中RNA CDR1as 高表達(dá)及miR-483-5p 低表達(dá)與乳腺癌的不良預(yù)后相關(guān)，檢測環(huán)狀RNA CDR1as 及miR-483-5p 的表達(dá)水平，有利于診斷乳腺癌以及評估預(yù)后。