李一帆，王 丹，王瑞琳，費 冰，劉 瑩，任彥穎，郭夢雨，劉心偉，李永偉

（1.河南中醫(yī)藥大學(xué)，鄭州 450046；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，鄭州 450002）

據(jù)2019 年世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）統(tǒng)計，癌癥目前是全球主要死亡原因之一，造成了巨大的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)，也是阻礙人類期望壽命延長的重要因素[1]。傳統(tǒng)的腫瘤治療方法如手術(shù)切除易受到腫瘤部位或腫瘤轉(zhuǎn)移的限制，而化療的主要缺點是藥物吸收到正?；蚰[瘤組織中的不良反應(yīng)以及抗腫瘤藥物耐藥性的出現(xiàn)。因此，以分子靶向治療和免疫治療為代表的精準(zhǔn)治療逐漸成為腫瘤治療的重點。

外膜囊泡（outer membrane vesicles，OMVs）是由革蘭氏陰性菌釋放的直徑約為20～250nm 的脂質(zhì)雙層囊泡狀結(jié)構(gòu)，含有多種親本菌的成分，包括酶、毒力因子、細菌特異性抗原和各種病原體相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns,PAMPs），如LPS，脂蛋白、肽聚糖、DNA 和RNA 等[2]。OMVs 含有的細菌抗原和各種PAMPs 可被宿主模式識別受體識別，從而增強細胞因子和共刺激分子的表達，促進抗原呈遞，有效激活宿主免疫系統(tǒng)，達到腫瘤免疫治療效果。此外，OMVs 的納米中空結(jié)構(gòu)有利于進行工程設(shè)計，使其作為抗腫瘤藥物的遞送載體，實現(xiàn)腫瘤靶向治療和化療-光療的結(jié)合。鑒于OMVs 在細菌疫苗、佐劑、腫瘤免疫治療劑、藥物遞送載體中的開發(fā)和應(yīng)用，其被認(rèn)為是抗腫瘤治療的新型手段，具有良好的應(yīng)用前景[3-5]。因此本文綜述OMVs 的結(jié)構(gòu)組分、提取方式、產(chǎn)生機制以及在抗腫瘤治療中的研究進展，為將來OMVs 的深入研究和臨床抗腫瘤應(yīng)用提供參考。

1 外膜囊泡概述

1.1 外膜囊泡的結(jié)構(gòu)組成 OMVs 是由革蘭氏陰性（G-）菌分泌的直徑約為20～250nm 的球形囊泡狀結(jié)構(gòu)，其由內(nèi)膜（inner membrane，IM）和外膜（outer membrane，OM) 雙層膜組成，中間是肽聚糖層（peptidoglycan，PG）和周質(zhì)空間（periplasmic space），外膜和肽聚糖層通過膜錨定蛋白（如Lpp,OmpA 和Tol-Pal 復(fù)合物）連接。OMVs 起源于細菌外膜，含有大量細菌外膜成分，如磷脂（phospholipid，PL），LPS，OMPs 以及一些來自IM 和OM 之間的周質(zhì)成分，它們在釋放過程中被包裹在囊泡腔中[6]。OMVs 包含多種PAMPs，能夠與宿主模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR）結(jié)合，從而激活宿主免疫系統(tǒng)，促進細胞因子分泌和細胞焦亡[7]。此外，OMVs 還可攜帶大量來自細菌的毒素、黏附素等，通過與宿主細胞相互作用，對癌細胞發(fā)揮細胞毒性作用，具有內(nèi)在的抗腫瘤活性[8]。由于OMVs 獨特的中空結(jié)構(gòu)和組成成分，其在革蘭氏陰性菌的感染、微生物-宿主間相互作用及其作為抗菌和抗腫瘤藥物遞送的載體等方面發(fā)揮著至關(guān)重要的功能。

1.2 外膜囊泡的形成機制 致病性和非致病性G-菌都會產(chǎn)生OMVs。目前關(guān)于OMVs 生物發(fā)生的研究成果提出了幾種主要的OMVs 模型。其中外膜曲率增加是被研究報道最多的一種G-菌OMVs 形成的機制。在細菌周質(zhì)空間中，錯誤折疊的蛋白質(zhì)或包膜成分（脂多糖和肽聚糖片段）的局部積累會對細菌外膜產(chǎn)生壓力，導(dǎo)致外膜膨脹，曲率增加并最終以O(shè)MVs 這種小泡的形式釋放出來[9]。還有研究發(fā)現(xiàn)，銅綠假單胞菌喹諾酮信號分子（Pseudomonas quinolonesignal,PQS），可插入外膜的外小葉來誘導(dǎo)其曲率增加，促進OMVs 形成[10]。

第二種機制是脂蛋白和肽聚糖交聯(lián)率降低。在大腸埃希菌中，與PG 共價交聯(lián)的脂蛋白（lipoprotein，Lpp）是一種維持細菌包膜結(jié)構(gòu)完整性的脂蛋白。有研究對Lpp-PG 交聯(lián)作用相關(guān)的基因進行敲除，發(fā)現(xiàn)PG 結(jié)構(gòu)和代謝的調(diào)節(jié)可以通過交聯(lián)Lpp 的水平上下調(diào)節(jié)OMVs 的產(chǎn)生[11]。OmpA 是另一種外膜脂蛋白，與肽聚糖層非共價結(jié)合。MARCHANT等[12]的研究也表明缺乏OmpA 的傷寒沙門菌突變體表現(xiàn)出OMVs 的產(chǎn)生增加。

磷脂的積累也會增加OMVs 的產(chǎn)生。最新的研究發(fā)現(xiàn)，VacJ/Yrb 基因沉默或刪除時會增加OM 外層小葉中的磷脂數(shù)量，導(dǎo)致富含磷脂的OMVs 從外膜表面分離[13]。此外，噬菌體介導(dǎo)的爆炸性細胞裂解和抗生素等也會促使OMVs 產(chǎn)生增加[14-15]。

1.3 外膜囊泡的分離鑒定 OMVs 從細菌細胞表面自然分泌，因此位于細菌培養(yǎng)物的無細胞上清液中。目前OMVs 的提取有多種方法，其中超速離心和密度梯度離心是分離和純化OMVs 最常用的方法，被稱為OMVs 分離的“金標(biāo)準(zhǔn)”[16]。超速離心和密度梯度離心的主要原理是根據(jù)培養(yǎng)上清液中不同顆粒的大小和密度設(shè)置不同的離心力，并利用平衡沉降原理完成OMVs 的純化。

當(dāng)前，對于OMVs 鑒定的三大主流方法分別是從OMVs 的形態(tài)、大小以及組分進行表征。透射電子顯微鏡（TEM）觀察OMVs 形態(tài)的方法被認(rèn)為是鑒定OMVs 的“金標(biāo)準(zhǔn)”。納米顆粒跟蹤分析（NTA）被用來測量OMVs 的粒徑大小。關(guān)于OMVs 的組分，脂質(zhì)可使用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC-MS）進行鑒定，蛋白質(zhì)組分通常使用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析OMVs 的蛋白質(zhì)譜[17]。

2 OMVs 在抗腫瘤治療中的應(yīng)用

OMVs 是源自革蘭氏陰性菌的天然生物納米材料，由于其納米級球形囊泡結(jié)構(gòu)，具有輕易穿過血管、淋巴管和組織的優(yōu)勢。OMVs 還含有細菌抗原和病原體相關(guān)分子模式（PAMPs），可以很容易地與免疫細胞相互作用或被免疫細胞攝取，被作為潛在的腫瘤治療的免疫佐劑或腫瘤靶向治療的藥物載體。重要的是，OMVs 可以通過細菌的基因工程進行功能修飾，從而為作為腫瘤納米疫苗遞送平臺的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

2.1 腫瘤靶向治療

2.1.1 OMVs 是納米級脂質(zhì)雙層囊泡結(jié)構(gòu)：OMVs是細菌在生長過程中連續(xù)釋放的20～250nm 的脂質(zhì)雙層囊泡狀結(jié)構(gòu)，其納米級的大小有助于它們通過淋巴引流或被吞噬的途徑被抗原呈遞細胞（antigen-presenting cells,APCs）攜帶進入淋巴結(jié)，通過激活免疫系統(tǒng)達到治療腫瘤的作用[18]。此外，OMVs 作為納米顆粒還具有高滲透長滯留效應(yīng)（EPR），與正常組織相比，其更容易滲透進入腫瘤組織并保持在腫瘤中積聚的能力，以誘導(dǎo)局部免疫。如源自大腸埃希菌的OMVs 在小鼠黑色素瘤的治療中，可以廣泛滲透進入角質(zhì)層和真皮層，通過透皮治療的方式直接將外部治療分子遞送到黑色素瘤部位[19]。OMVs 作為透皮和腫瘤靶向藥物遞送的納米平臺，具有高效率和生物安全性，在淺表腫瘤的治療中具有巨大潛力。

2.1.2 OMVs 作為抗腫瘤藥物靶向遞送的載體：為了避免腫瘤免疫治療過程中的免疫抑制狀態(tài)，需要聯(lián)合藥物治療來進一步增強OMVs 的腫瘤免疫治療潛力，從而徹底根除腫瘤并防止腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。OMVs 在復(fù)雜的革蘭氏陰性細胞包膜上遞送生物大分子的獨特能力，為其作為藥物遞送載體提供了較大的優(yōu)勢。KUERBAN 等[20]的研究證明了來自減毒肺炎克雷伯菌的OMVs 作為一種生物藥物遞送載體，已成功用于將抗腫瘤藥物阿霉素（DOX）轉(zhuǎn)運到非小細胞肺癌細胞系中，并抑制小鼠模型中的腫瘤生長。該研究還提出OMVs 可以募集TME 巨噬細胞，觸發(fā)適當(dāng)?shù)拿庖叻磻?yīng)，從而增強DOX 的抗腫瘤作用，且未觀察到明顯的毒性。另外還有研究將紫杉醇（PTX）、小干擾RNA 等通過巨噬細胞攝取或電穿孔的方法加載到OMVs 中，以到達腫瘤部位發(fā)揮抗腫瘤作用[21]。最新的一項關(guān)于OMVs抗腫瘤治療的研究還聯(lián)合光動力療法/化療/免疫療法來治療三陰性乳腺腫瘤，發(fā)現(xiàn)這種治療策略在根除腫瘤上具有很強的功效，還能有效地防止腫瘤向肺部的轉(zhuǎn)移[22]。

2.2 腫瘤免疫治療 OMVs 可激活宿主免疫系統(tǒng)，攻擊和清除腫瘤細胞。細菌抗原和多種PAMPs 的共存使OMVs 作為免疫刺激劑具有巨大的潛力。其在細胞外和細胞內(nèi)可被宿主模式識別受體（PRR）所識別，從而激活宿主免疫系統(tǒng)，刺激抗原呈遞細胞，并導(dǎo)致T 細胞成熟，進而對OMVs 產(chǎn)生強大的體液和細胞免疫應(yīng)答[23]。OMVs 還攜帶來自親本菌的LPS，黏附素和毒力因子。這些物質(zhì)可通過分泌抗腫瘤免疫反應(yīng)的細胞因子如干擾素-γ，腫瘤壞死因子-α 等，進而引起腫瘤損傷[24-25]。OMVs通過干擾素-γ 介導(dǎo)的抗腫瘤反應(yīng)不僅能清除腫瘤，而且其抗腫瘤反應(yīng)具有長期記憶作用，可減少腫瘤的復(fù)發(fā)[25]。還有研究表明來自鼠傷寒沙門氏菌的OMVs 可通過激活宿主免疫系統(tǒng)和逆轉(zhuǎn)免疫抑制腫瘤微環(huán)境來促進腫瘤消退[26]。其中注射OMVs 的小鼠腫瘤細胞不僅受到NK 細胞的殺傷而且發(fā)生了細胞自噬和凋亡。由此可見，細菌OMVs 作為新型腫瘤免疫治療劑具有巨大潛力，可以觸發(fā)對各種癌癥的有效抗腫瘤反應(yīng)，而不會產(chǎn)生顯著的不良反應(yīng)。

2.3 腫瘤疫苗 OMVs 是脂質(zhì)納米囊泡結(jié)構(gòu)，含有多種蛋白和特異性抗原，由于其免疫調(diào)節(jié)和向宿主細胞呈遞多種異源抗原的能力，OMVs 可以設(shè)計為一種有效的腫瘤治療性疫苗，通過基因工程將腫瘤抗原或小分子藥物遞送到APCs 甚至靶向癌細胞，因此在疫苗開發(fā)中具有巨大潛力。相比被動免疫治療，腫瘤疫苗的優(yōu)勢在于T 細胞驅(qū)動的反應(yīng)和相關(guān)記憶可能在疾病復(fù)發(fā)期間提供幫助。

基因工程領(lǐng)域的進步促使OMVs 作為腫瘤疫苗平臺的進一步改進，從而提高產(chǎn)量，降低LPS 和磷壁酸對OMVs 的毒性，并用同源和異源抗原進行修飾，以增強免疫原性并提供更廣泛的保護。OMVs 經(jīng)基因和化學(xué)修飾將被賦予更多的功能。為了解決自然釋放OMVs 的低產(chǎn)量和脂多糖可能帶來的毒性作用，有研究人員開發(fā)了一種膜抗原的通用模塊（GMMA），即工程化的OMVs[27]，以增強自然OMVs 的形成、降低反應(yīng)性和毒性及過表達免疫原性抗原。ROSSI 等[28]的研究通過敲除?；D(zhuǎn)移酶基因msbB 或htrB 來修飾LPS 的內(nèi)毒性部分脂質(zhì)A，從而降低其反應(yīng)原性。據(jù)報道，通過基因工程方法將腫瘤抗原人瘤病毒16 型早期蛋白E7（HPV16E7）呈遞在大腸埃希菌衍生的OMVs 上，獲得重組的OMVs 疫苗。將該疫苗接種在移植TC-1 宮頸癌細胞的小鼠可顯著抑制腫瘤的生長[29]。還有研究人員通過基因工程技術(shù)改進了OMVs 的遞送能力，使用納米膜過濾器通過連續(xù)擠出制備表面表達腫瘤靶向的細菌原生質(zhì)體納米囊泡，為實體腫瘤部位提供受體介導(dǎo)的被動靶向。加載化療藥物的原生質(zhì)體納米囊泡顯示出劑量依賴性細胞毒性和腫瘤組織靶向特異性，并有效預(yù)防腫瘤異種移植小鼠的腫瘤生長[30]?；蚬こ蘋MVs 在抗腫瘤作用中的巨大貢獻，為其作為有效和安全的抗腫瘤疫苗提供了巨大的潛力，以優(yōu)化和促進腫瘤治療的發(fā)展。

3 未來與展望

近年來腫瘤發(fā)病率的激增促使研究人員致力于開發(fā)新型抗腫瘤藥物和手段。盡管大量的研究發(fā)現(xiàn)了OMVs 作為佐劑、腫瘤治療劑和藥物遞送載體以及工程細菌OMVs 作為腫瘤疫苗平臺的巨大潛力。在OMVs 的抗腫瘤治療中，提高OMVs 的安全性并保持佐劑效力以及使用OMVs 進行個性化治療仍需要進一步改進。此外，腫瘤的異質(zhì)性可能需要開發(fā)出具有普遍抗腫瘤效應(yīng)類型的OMVs。當(dāng)前，OMVs 作為腫瘤治療劑或進行腫瘤疫苗開發(fā)還在實驗室研究階段，在廣泛臨床應(yīng)用之前，仍有許多問題需要解決。