陳雪靜 韓 婷 馬艷茹 徐 蕊 姜盼盼 黃嘉雯

1.內(nèi)蒙古巴彥淖爾市臨河區(qū)婦幼保健院 (內(nèi)蒙古 巴彥淖爾市 015000)

2.深圳罕見病代謝組學(xué)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)工程研究中心 (廣東 深圳 518107)

3.深圳愛灣醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室 (廣東 深圳 518107)

苯丙酮尿癥(HPA)是一種常染色體隱性遺傳病，主要是由于苯丙氨酸羥化酶(PAH)及其輔酶四氫蝶呤(BH4)缺乏導(dǎo)致，前者缺失稱之為經(jīng)典型PKU，后者的缺失為四氫蝶呤缺乏癥(BH4D)[1]。6-丙酮酰四氫蝶呤合成酶(PTPS)缺失是導(dǎo)致四氫蝶呤缺乏癥的主要原因，約占BH4D 的60%[2]。尿中新蝶呤、生物蝶呤及生物蝶呤的百分比是診斷6-丙酮酰四氫蝶呤合成酶是否缺失的關(guān)鍵指標(biāo)[3]。目前尿液前處理方法主要有兩種，一是用酸性碘化鉀將還原態(tài)的BH4、BH2氧化為N和B，二是用MnO2進(jìn)行氧化[4-5]。本文主要用酸性碘化鉀進(jìn)行氧化，該方法操作簡單，具有高靈敏度，高準(zhǔn)確度，適用于檢測小兒尿液中的新蝶呤和生物蝶呤。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器試劑儀器：島津LC-2 0 A 配合熒光檢測器(日本SHIMADZU公司)；RL-821型旋渦振蕩混合器(北京八方世紀(jì)科技有限公司)；1730QT型超聲波清洗器(北京科璽世紀(jì)科技有限公司)；Dragonlab移液槍(可調(diào)范圍：20～200μL、100～1000μL，EPPENDORF 中國有限公司)；AUX320島津分析天平(日本SHIMADZU公司)。

試劑：新蝶呤標(biāo)準(zhǔn)品(CAS No:2009-64-5)、生物蝶呤標(biāo)準(zhǔn)品(CAS:22150-76-1)、氫氧化鈉(分析純，天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)；鹽酸(優(yōu)級純，湖南凱信公司)；碘化鉀(上海安譜實(shí)驗(yàn)科技有限公司)；碘單質(zhì)(上海安譜實(shí)驗(yàn)科技有限公司)；抗壞血酸(永華化學(xué)科技(江蘇)有限公司)；實(shí)驗(yàn)用水使用Milli-Q純水系統(tǒng)(美國MIlli-pore公司)制備。

1.2 色譜條件色譜柱：Kromasil EternityXT C18色譜柱(4.6mm*250mm，5μm)；流動相：甲醇:水(10:90)；流速：1.0～4.0 min，總流速為0.6mL/min；4.01～11.0min，總流速為1.0mL/min;11.01～20min，總流速為0.6mL/min；檢測器：激發(fā)波長350nm，發(fā)射波長460nm；柱溫：22 ℃；進(jìn)樣量：20μL。

1.3溶液配制 0.1mol/L NaOH溶液：準(zhǔn)確稱量0.100g氫氧化鈉固體于燒杯中，溶解后轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶，混勻配成0.1mol/L溶液。6.0mol/L HCI溶液：準(zhǔn)確吸取10mL鹽酸(體積分?jǐn)?shù)是36.0%～38.0%)，用超純水定容至20mL，混勻配制成6.0mol/L溶液。0.1mol/L鹽酸：取200μL 6mol/L鹽酸溶液加水定容到12 mL，0.05mol/L I2-KI溶液：將2.6g KI溶解于50mL水中，然后加入0.325g I2單質(zhì)充分溶解。0.05 mol/L抗壞血酸：稱取0.44g固體粉末溶解于50mL水中。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：分別精密稱取新蝶呤對照品10mg，生物蝶呤對照品5mg于25mL容量瓶中，用0.1mol/L氫氧化鈉溶解并稀釋至刻度，搖勻，得到400μg/mL的新蝶呤儲備液和200μg/mL的生物蝶呤儲備液，置-4℃的冰箱保存。取一定量的新蝶呤和生物蝶呤配制成混合標(biāo)準(zhǔn)液(新蝶呤16.0μg/mL，生物蝶呤17.28μg/mL)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 將1.3中混合的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照等比例稀釋方式，用0.1 mol/L鹽酸稀釋成以下濃度：新蝶呤：1.0，0.5，0.2，0.1，0.05，0.025，0.0125，0.00625μg/mL；生物蝶呤：1.08，0.54，0.216，0.108，0.054，0.027，0.0135，0.00675μg/mL。依次進(jìn)樣，以峰面積對濃度做線性回歸方程，分別得到新蝶呤和生物蝶呤的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.2 樣品的預(yù)處理 取原尿樣品1mL，置于10mL試管中，加入6mol/L鹽酸75uL，使pH為1～2，加入0.05mol/L I2-KI溶液1mL，暗處室溫放置30min，滴加0.05mol/L抗壞血酸還原液1mL，用水定容至5mL，搖勻，過微孔濾器，取20μL進(jìn)樣分析。

2 結(jié) 果

2.1 線性范圍與檢出限按照1.4.1配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，新蝶呤在0.00625-1.00μg/mL內(nèi)線性良好，線性回歸方程為：Y=1*10^7X -40274，相關(guān)系數(shù)：r=0.9999；生物蝶呤在0.00675-1.08μg/mL內(nèi)線性良好，線性回歸方程為：Y=1*10^7X - 58688，相關(guān)系數(shù)：r=0.9999。

2.2 回收率

2.2.1 批內(nèi)精密 加入一定體積及濃度的混標(biāo)，使新蝶呤的濃度分別為0.0125，0.1，0.5μg/mL，生物蝶呤的濃度分別為0.0135，0.108，0.54μg/mL，探究樣品在3個(gè)濃度下的批內(nèi)精密度。由表1可見，新蝶呤和生物蝶呤的批內(nèi)精密度在94.35%～101.96%，RSD<6%。

表1 新蝶呤和生物蝶呤批內(nèi)精密度(n=3)

2.2.2 批間精密度 加入一定體積及濃度的混標(biāo)，使新蝶呤的濃度分別為0.0125，0.1，0.5μg/mL，生物蝶呤的濃度分別為0.0135，0.108，0.54μg/mL，連續(xù)測試4day，考察批間精密度。

2.3 樣品的穩(wěn)定性按照樣品前處理方法平行處理3份樣本，置于15 ℃保存，連續(xù)進(jìn)樣5day，探究樣品的穩(wěn)定性。樣品的穩(wěn)定性結(jié)果如圖1，新蝶呤和生物蝶呤峰面積隨放置時(shí)間延長而下降，且這種下降關(guān)系并不是同步的。因此，當(dāng)天處理的樣本最好在當(dāng)天完成目標(biāo)物測定。

表2 新蝶呤和生物蝶呤批間精密度(n=3)

圖1 樣品穩(wěn)定性的探究(a為新蝶呤，b為生物蝶呤)。圖2 峰面積隨氧化時(shí)間變化情況(a為新蝶呤，b為生物蝶呤)。

3 討 論

3.1 液相方法的選擇優(yōu)化

3.1.1 流速的選擇與優(yōu)化 分別使用不同的流速進(jìn)樣探究最優(yōu)方式。方法包括：恒流速0.6mL/min、0.7mL/min、0.8mL/min、0.9mL/min、1.0mL/min；變流速(流速為0.6mL/min，出峰位置流速為1.0mL/min)。比較各方法譜圖顯示采用變流速的方法進(jìn)樣，新蝶呤和生物蝶呤出峰效果最佳。

3.1.2 柱溫的選擇與優(yōu)化 樣品中目標(biāo)物與雜質(zhì)的分離度對物質(zhì)的定量分析有很大影響。柱溫影響分離度，故探究柱溫對樣品分離情況影響。方法包括：通過選擇不同溫度條件進(jìn)行探究，對比各譜圖中目標(biāo)峰與雜質(zhì)峰分離情況。發(fā)現(xiàn)在22℃時(shí)，樣品中的新蝶呤及生物蝶呤與雜質(zhì)峰能達(dá)到最好的分離效果，故柱溫選擇22℃。

3.2 樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化

3.2.1 前處理方法的比較 尿液中的成分相對復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)中為了確保準(zhǔn)確性，對尿液進(jìn)行兩種前處理：(1)取原尿樣品1mL，置于10mL試管中，加入6mol/L鹽酸75μL，使pH為1～2，加入0.05 mol/L I2-KI溶液1mL，暗處室溫放置30min，滴加0.05mol/L抗壞血酸還原液1mL，用水定容至5mL，搖勻，過微孔濾器，取20μL進(jìn)樣分析。(2)取原尿樣品500μL，加入50μL 1mol/L HCl，再加入10mg MnO2，離心過濾，測肌酐濃度，并以0.1mol/L HCl稀釋，使肌酐濃度在20-30mg/L，取20μL進(jìn)樣分析。結(jié)果：與方法(2)相比，方法(1)的峰分離度較好、回收率高，且操作比較簡單，故采用方法(1)進(jìn)行樣本前處理。

3.2.2 氧化時(shí)間的選擇 實(shí)驗(yàn)探究 10min、20min、30min、40min、50min、60min的氧化時(shí)間對檢測新蝶呤和生物蝶呤的影響。結(jié)果如圖2，發(fā)現(xiàn)較其他時(shí)間相比，氧化時(shí)間在30min時(shí)，新蝶呤和生物蝶呤峰面積較大，氧化比較完全。

3.2.3 酸性的影響 新蝶呤和生物蝶呤通常以氧化態(tài)和還原態(tài)的形式存在，在酸性環(huán)境中比較穩(wěn)定[6-7]， Slazyk等[8]等報(bào)道，生物蝶呤在酸性條件下回收率會升高。故探究實(shí)驗(yàn)中加鹽酸與不加鹽酸對兩種蝶呤的影響。對照組正常加入6mol/L的鹽酸對尿液進(jìn)行酸化，再進(jìn)行氧化；而實(shí)驗(yàn)組則不加鹽酸，直接進(jìn)行氧化，結(jié)果顯示，與加入了鹽酸的對照組相比，未加鹽酸條件下的新蝶呤和生物蝶呤含量降低一半左右。

3.2.4 光照的影響 新蝶呤、生物蝶呤在光照條件下易分解，孟英韜等[9]提出,取新蝶呤、生物蝶呤等樣品混合液，用正午太陽光光照30 min，新蝶呤、生物蝶呤全消失，且新蝶呤前出現(xiàn)一大峰。為防止實(shí)驗(yàn)中光照對尿蝶呤中新蝶呤和生物蝶呤含量的影響。把實(shí)驗(yàn)分為兩組，實(shí)驗(yàn)組放在實(shí)驗(yàn)室強(qiáng)光的地方氧化，對照組放置暗處氧化，測過結(jié)果顯示兩組測得的新蝶呤和生物蝶呤無明顯的差異。故普通的實(shí)驗(yàn)光照對本實(shí)驗(yàn)無明顯的影響。

4 結(jié) 論

本文建立了高效液相色譜-熒光檢測法同時(shí)測定以尿?yàn)V紙片形式為檢測樣本中新喋呤和生物蝶呤的含量，并通過分別計(jì)算新喋呤、生物蝶呤與尿肌酐的濃度比值，以及B%，可有效的鑒別出BH4缺乏癥患者。基于優(yōu)化色譜條件和實(shí)驗(yàn)條件，該方法靈敏度高、選擇性強(qiáng)、分析時(shí)間短，且穩(wěn)定性、精密度和加標(biāo)回收率都符合分析要求；此外，本實(shí)驗(yàn)的檢測樣本相對于原尿液來說，運(yùn)輸更方便，保存時(shí)間更長，制作簡單，前處理簡便，結(jié)果較好，可在短時(shí)間內(nèi)測定大批量樣品，適用于臨床檢測，為尿蝶呤譜分析提供了新的檢測方法，形成一套能夠在臨床上應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)操作流程，對鑒別HPA分型和患兒的治療及預(yù)防發(fā)病具有重要意義。