郭梨梨 韓 玉 翟敬芳1,*

1.蚌埠醫(yī)學院研究生院 (安徽 蚌埠 233000)

2.徐州醫(yī)科大學徐州臨床學院 (江蘇 徐州 221009)

3.徐州市中心醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心 (江蘇 徐州 221009)

染色體疾病是出生缺陷人群最常見的遺傳病，其中非整倍體的發(fā)生與同源染色體不分離有關，隨著女性妊娠年齡的增加，胎兒非整倍體的發(fā)生率增加[1]，但染色體微缺失、微重復的發(fā)生與妊娠年齡無關[2-3]。隨著對染色體微缺失/微重復綜合征(chromosome microdeletion/microduplication syndromes, MMS)的深入研究，微缺失、微重復綜合征文獻報道的種類超過300種，累積發(fā)病率約為1.0-2.5%[4-7]，即使在結(jié)構正常染色體核型正常的胎兒中拷貝數(shù)變異累計發(fā)生率為1～1.7%。微缺失/微重復綜合征具有復雜的臨床表現(xiàn)如特殊面容、精神行為改變等[8]，常合并生長發(fā)育異常、智力缺陷，生活不能自理，給社會及家庭帶來極大的危害。相關指南推薦對妊娠婦女進行相關篩查[4]，美國醫(yī)學遺傳學會(ACMG)推薦無創(chuàng)產(chǎn)前篩查(Non-invasive prenatal screening, NIPS)對年輕孕婦進行22q11缺失綜合征篩查[9]，但傳統(tǒng)的NIPS局限于21三體、18三體、13三體及性染色體，對胎兒染色體微缺失/微重復篩查的效能低，侵入性產(chǎn)前診斷需要人力及實驗室條件要求，擴展性無創(chuàng)產(chǎn)前基因篩查(expanded noninvasive prenatal screening, NIPS-Plus)能夠滿足臨床對胎兒染色體微缺失及微重復篩查的需要，現(xiàn)將其在胎兒染色體微缺失及微重復中的應用情況作一綜述。

1 NIPS-Plus技術原理及實驗流程

NIPS-Plus是NIPS檢測升級版，也是基于高通量測序技術原理對母體外周血胎兒游離DNA進行序列測定。相對NIPS而言，NIPS-Plus在測序數(shù)據(jù)量和算法方面做了很大改進，使檢測范圍更加廣泛，臨床價值高于NIPS[10-11]。NIPS-Plus測序深度較NIPS增加2～3倍(～0.4 X，reads數(shù)量為800萬條)，有更好的檢測性能[12]。NIPS-Plus技術實驗流程與NIPS相似，包括血漿DNA提取分離、DNA文庫構建、文庫擴增及上機測序分析三個過程，實驗流程按照實驗室相關規(guī)定的標準操作規(guī)程(SOP)進行，對測序結(jié)果進行分析判斷， 不同公司的檢測方法使用的測序平臺、實驗方案、測序方法以及納入的樣本量及測序數(shù)據(jù)量等方面存在差異，但均具有較高的靈敏度和特異度。

2 質(zhì)量控制程序

NIPS-Plus實驗室質(zhì)控嚴格遵循相關規(guī)范指南[13-14]。首先，采樣前超聲檢測證實為活胎，醫(yī)生需與孕婦進行充分的知情告知NIPS-Plus檢測指征以及局限性如染色體平衡易位、多倍體等。同時，注意排查可能存在明顯影響結(jié)果準確性的情況如干細胞治療、1年內(nèi)接受過異體輸血等。按照規(guī)定的采樣管進行樣本收集，條型碼確保唯一，血漿無嚴重溶血。如系院外檢測，血漿及DNA 樣本采用干冰運輸，短期保存-20℃，超過7天需在-80℃保存，以上均為檢測前質(zhì)控。

檢測過程質(zhì)量控制：有資質(zhì)的檢測人員應在具備NIFTY環(huán)評標準實驗室按照標準操作規(guī)程進行實驗。使用經(jīng)CFDA批準的體外診斷試劑盒，設置空白對照和陰陽性對照，使用Qubit熒光定量儀進行文庫定量質(zhì)量控制，對檢測結(jié)果陽性的臨床樣本應對該樣本進行再次驗證。報告生成環(huán)節(jié)需在系統(tǒng)信息完成審核、分析等檢測后質(zhì)控環(huán)節(jié)，同時應加強對NIPS-Plus發(fā)現(xiàn)的陽性、陰性及檢測失敗病例的管理。國內(nèi)大多數(shù)實驗室采用的是NextSeq CN500 (Illumina)和 BGISEQ-500平臺，不同的平臺產(chǎn)生的reads數(shù)及有效數(shù)據(jù)量有不同的要求。

3 NIPS-Plus檢測效能及適用人群

從理論上來說，NIPS-Plus能夠檢測出預設閾值以上的微缺失、微重復片段，但由于母體外周血胎兒濃度、測序所覆蓋的深度等不同，NIPS-Plus對具體的微缺失微重復檢測的效能不同[15-16]。關于NIPS在產(chǎn)前篩查中的應用早在2015年國際產(chǎn)前診斷協(xié)會(International Society forPrenatal Diagnosis，ISPD)推薦NIPS檢測適用于全人群產(chǎn)前篩查[17]，2020年美國婦產(chǎn)科醫(yī)師學會(american college of obstetricians and gynecologists，ACOG)推薦NIPS可替代傳統(tǒng)血清學篩查作為全人群產(chǎn)前篩查的首選項目，而不建議進行多種產(chǎn)前血清學篩查方法，但提醒臨床醫(yī)師無論篩查結(jié)果如何，所有篩查孕婦都需要進行超聲檢查[18]。對于胎兒染色體拷貝數(shù)方面的研究，2016年美國醫(yī)學遺傳學會推薦NIPS對年輕孕婦進行22q11缺失綜合征篩查[9]，2020年廣東省精準醫(yī)學應用學組推薦NIPS對致病明確的微缺失微重復片段進行NIPS篩查[19]。NIPS對拷貝數(shù)變異(copy number variations,CNVs)的檢出率較低，NIPS-Plus在對CNVs檢出彰顯其優(yōu)勢[9]。與NIPS比較，梁德生等學者基于2015年至2018年對94085例大樣本孕婦NIPSPlus檢測發(fā)現(xiàn)對胎兒非整倍體(13、18、21、性染色體)和MMs篩查的特異度均大于99%，對Digeorge的陽性預測值(positive predictive value, PPV)93%，接近T21篩查的陽性預測值95%，對22q11.22重復綜合征、prder - willi /Angleman和Cri du Chat綜合征的PPV也在50%以上，推薦NIPS-Plus作為一線的篩查方法應用于臨床[6]。另外，廣州婦女兒童醫(yī)學遺傳中心應用對7710例選擇NIPS-Plus妊娠婦女與42969例妊娠婦女進行NIPS的對比研究發(fā)現(xiàn)，對于不同大小的拷貝數(shù)變異，如DiGeorge綜合征、Prader Willi綜合征、貓叫綜合征等，NIPS-Plus均展現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢，NIPS-Plus的檢出率提高了1.02% (0.58% vs 1.60%)，>10Mb的CNVs的PPV明顯高于NIPS組(P<0.05)，NIPS- Plus較NIPS檢測的總PPV 明顯比NIPS高(43.61% vs 30.96%)[12]。

NIPS-Plus檢測的理論基礎與NIPS相似，均是胎兒游離DNA(cell free fetal DNA,cff-DNA)，因此兩種檢測方法的適用人群相似，可以參照國衛(wèi)辦婦幼發(fā)〔2016〕45號文件關于適用人群、慎用人群及禁用人群的規(guī)定[13]。2015～2018年在一項42910例大樣本研究中，NIPS無論在以臨界高風險為主的適用人群還是在高齡和超聲軟指標異常及血清學高風險人群中，對21三體均有較高的預測價值，PPV高達70%以上，最高達100%；在超聲結(jié)構異常的禁用人群中，18三體和CNVs的PPV均達到了100%[7]，而后者常合并胎兒結(jié)構異常，因此胎兒結(jié)構異常中染色體非整倍體和微缺失微重復的概率增高，這一點與大多數(shù)文獻報道一致[20]。陳藝升等人研究發(fā)現(xiàn)NIPS-Plus臨床檢測指征中，高齡PPV(77.8%)最高，對血清學篩查高風險或處于臨界風險、超聲軟指標或結(jié)構異常的PPV分別為55.1%、73.9%[21]。陸婁愷奕等人對1312例IVF孕婦進行了NIPS與NIPS-Plus復合檢測，發(fā)現(xiàn)NIPS及NIPS-Plus對體外受精與胚胎移植(invitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET)胎兒的非整倍體篩查的PPV均超過80%，這說明NIPS-Plus對IVF-ET妊娠人群篩查具有一定的應用價值[22]。但丁昭寧等通過研究認為NIPS-Plus在CNVs的檢測中對常見染色體疾病如21、18-三體的檢測中陽性預測值較高，而在微缺失/微重復、性染色體異常等檢測中陽性預測值尚需進一步提高[23]。

4 NIPS-Plus技術臨床應用優(yōu)勢

NIPS-Plus是一種升級版的胎兒染色體拷貝數(shù)變異篩查技術，通過增加測序深度、擴大檢測范圍對胎兒染色體拷貝數(shù)變異進行篩查。NIPS-Plus技術檢測的范圍更加全面，可以發(fā)現(xiàn)多種胎兒染色體異常，包括21、18及13-三體的24種常染色體非整倍體疾病、4種性染色體非整倍體疾病、百余種>3Mb的胎兒染色體缺失/重復綜合征[22-24]。吳夢詩等于2021年總結(jié)中提出對于染色體微缺失發(fā)生頻繁高的年輕女性，建議進行 NIPS-Plus篩查[25]。2021年鄭州大學第一附屬醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心通過對64135例妊娠婦女11～14周進行NIPS與NIPS-Plus對比檢測，并同步結(jié)合超聲篩查，證實了NIPS-Plus不僅對常規(guī)的非整倍體篩查具有很好的臨床應用潛力，而且對在妊娠早期超聲篩查中沒有異常的MMS也具有臨床檢測效能[26]，推薦超聲和NIPS- Plus結(jié)合后續(xù)的遺傳咨詢可以作為對所有孕婦的一種全面的一線篩查方法。2022年最新研究表明NIPS-Plus對高齡孕婦的胎兒SCAs和染色體非整倍體篩查方面優(yōu)于年輕孕婦[27]。對于NIPS對于高齡妊娠人群中的研究發(fā)現(xiàn)，與孕產(chǎn)婦的年齡呈負相關[28]，但cffDNA含量與孕齡呈正相關，由于NIPS-Plus對cffDNA有較高的富集程度，NIPS-Plus更適合作為高齡孕婦的早期篩查手段。

5 NIPS-Plus技術的局限性

臨床醫(yī)師在使用NIPS-Plus之前，需要深入了解該技術的局限性，方便對檢測結(jié)果的遺傳咨詢和后期隨訪處理。NIPS-Plus PPV和陰性預測值受到研究過程中多種因素的影響，隨著基因組CNVs數(shù)量的增加，假陽性和陰性結(jié)果預計會增加。隨著測序深度的增加，NIPS-Plus勢必檢測出更多的微缺失微重復片段[12]，臨床上進行產(chǎn)前診斷對意義不明的拷貝數(shù)變異一方面增加了產(chǎn)前診斷成本，另一方面無疑增加了產(chǎn)前診斷咨詢的難度，其中NIPSPlus檢測出的小于5～10Mb的染色體變異，但對于未發(fā)生基因劑量變化的染色體結(jié)構異常無法判斷[29]，以上這些都需要后續(xù)的實踐和研究來提高其準確性。另外，由于母體因素、胎盤滋養(yǎng)層細胞、性染色體互換因素、限制性胎盤嵌合等因素可能會導致假陽性及假陰性結(jié)果的出現(xiàn)[16]。與NIPS相比，NIPS-Plus目前檢測費用較高，一定程度上限制了其在臨床上的廣泛應用。

6 總結(jié)及發(fā)展前景

總而言之，微缺失/微重復綜合征臨床發(fā)病率較高，NIPSPlus對胎兒拷貝數(shù)變異檢測不是確診的手段，但其能一定程度上滿足臨床對胎兒染色體微缺失及微重復篩查的需要，緩解臨床產(chǎn)前診斷的壓力，實現(xiàn)了更加全面的出生前對胎兒染色體篩查。隨著分子檢測技術的發(fā)展，越來越多的孕婦傾向于選擇NIPS。同時，隨著測序價格的降低，NIPS-Plus有望成為孕婦首選的一線產(chǎn)前篩查技術。但仍需要對NIPS-Plus應用產(chǎn)前篩查方面做深入的研究,使其在指導優(yōu)生優(yōu)育方面有更近一步的突破。