解學(xué)芳，焦玲，田斌，常曉雨

肝細(xì)胞癌(HCC)是原發(fā)性肝癌的主要類型，占89%～90%，其死亡率約占相關(guān)癌癥死亡原因的第三位[1-2]。我國是肝癌的高發(fā)國家，肝癌死亡率僅次于肺癌，排第二位，給我國人民健康帶來嚴(yán)重威脅[3]。HCC早期無特異性臨床表現(xiàn)癥狀，一旦出現(xiàn)乏力、黃疸、疼痛相關(guān)癥狀來醫(yī)院就診時大多處于中晚期，從而喪失了早期最佳手術(shù)、介入等治療機(jī)會，患者預(yù)后極差。超聲、CT是肝癌常規(guī)影像學(xué)檢查方法，但對于小肝癌容易造成誤診和漏診[4]。血清腫瘤相關(guān)標(biāo)志物檢查在惡性腫瘤的早期診斷及預(yù)后隨訪中越來越受到臨床關(guān)注。甲胎蛋白(AFP)一直作為診斷HCC最為經(jīng)典、應(yīng)用最為廣泛的標(biāo)志物，但仍有20%～30%HCC患者血清呈陰性；甲胎蛋白異質(zhì)體L3(AFP-L3)為肝癌細(xì)胞所特有，診斷HCC特異性高，但仍有15%～30%的HCC患者表達(dá)陰性[5]。miRNAs是一類非編碼單鏈小RNA分子，在機(jī)體生理、病理等生命活動中發(fā)揮著重要生物學(xué)作用，其表達(dá)異常嚴(yán)重影響細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，致使細(xì)胞增殖和分化異常從而失去控制，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[6]。微小RNA-21(miRNA-21)是發(fā)現(xiàn)和研究較早的miRNA之一，研究表明[7]miRNA-21異常表達(dá)與HCC發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可作為新型標(biāo)志物用于HCC診斷。本研究擬選擇血清miRNA-21、AFP、AFP-L3三項(xiàng)標(biāo)志物聯(lián)合檢測，評價其在HCC診斷與預(yù)后評估中的價值。

1 臨床材料與方法

1.1 臨 床 材 料 收 集2016 年1 月 至2018 年12 月101例來日照市人民醫(yī)院就診的HCC患者為研究對象列為HCC組，均經(jīng)病理組織學(xué)確診。男58例，女43例；年齡39～82歲，平均年齡(58.97±15.46)歲。另選取50例肝臟良性病變患者作為對照組，包括乙肝、丙肝、肝硬化等，男33例，女17例；年齡36～85歲，平均年齡(59.26±14.37)歲，均經(jīng)影像學(xué)、血清學(xué)、病理組織學(xué)排除癌變。兩組人群性別、年齡等基線資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 選取標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2019年版)》診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]；均為首次確診者；研究所需資料齊全；患者知情同意，全程配合該項(xiàng)研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除非原發(fā)性肝癌患者；排除伴有其他系統(tǒng)惡性腫瘤患者；排除研究所需資料不全者。

1.3 方法 早06：00—09：00時空腹抽取兩組患者肘靜脈血8 mL，自凝后離心分離血清待檢。miRNA-21采用實(shí)時定量熒光聚合酶鏈反應(yīng)法檢測，抽提總RNA試劑盒(Molecular Research Centre公司，美國)，合成第一鏈cDNA試劑盒(Fermentas公司，以色列)，qRT-PCR引物(miR-21和miR-16)(上海英駿生物公司)，PCR儀購于美國Bio-Rad公司，以miRNA-16作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt的方法計算血清miRNA-21 相對表達(dá)量；AFP 采用德國羅氏公司ELecsys-2010 及配套試劑電化學(xué)發(fā)光法檢測；AFP-L3采用親和吸附離心管法檢測，試劑盒由北京熱景生物技術(shù)有限公司提供，以2005年美國FDA設(shè)定AFP-L3/AFP≥10%作為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 結(jié)果判定 血清miRNA-21、AFP、AFP-L3單項(xiàng)檢測超過臨界值即判定為診斷HCC陽性，等于或低于臨界值即判定為診斷HCC陰性；血清miRNA-21、AFP、AFP-L3聯(lián)合檢測有一項(xiàng)或一項(xiàng)以上指標(biāo)超過臨界值即判定為診斷HCC陽性，均等于或低于臨界值即判定為診斷HCC陰性。

1.5 預(yù)后隨訪 患者出院后對其定期追蹤回訪，隨訪時間3～36個月。囑患者自初次治療結(jié)束后定期來醫(yī)院復(fù)查，復(fù)查頻率為每3個月一次，復(fù)查內(nèi)容包括血清學(xué)及影像學(xué)檢查。隨訪過程中發(fā)現(xiàn)有復(fù)發(fā)灶、新的轉(zhuǎn)移灶或死亡均被定義為“事件”，隨時停止隨訪；至隨訪終點(diǎn)未發(fā)現(xiàn)新的復(fù)發(fā)灶、無發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)移灶或無死亡均被定義為“無事件”。記錄每次患者復(fù)查資料。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 研究所得數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 23.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示計量資料，行t檢驗(yàn)；以率[n(%)]表示計數(shù)資料，行χ2檢驗(yàn)；生存分析利用Kaplan-Meier 法及Log-rank檢驗(yàn)；以病理診斷結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，用四格表法統(tǒng)計計算血清miRNA-21、AFP、AFP-L3 單項(xiàng)、兩兩組合及三項(xiàng)聯(lián)合檢測診斷HCC價值。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCC組與對照組血清miRNA-21、AFP、AFP-L3水 平 比 較 HCC 組 患 者 血 清miRNA-21、AFP、AFP-L3水平明顯高于良性對照組(P＜0.01)，見表1。

表1 HCC組與對照組血清miRNA-21、AFP、AFP-L3水平比較(±s)

表1 HCC組與對照組血清miRNA-21、AFP、AFP-L3水平比較(±s)

注：miRNA-21=微小RNA-21，AFP=甲胎蛋白，AFP-L3=甲胎蛋白異質(zhì)體L3，下同；與對照組比較，aP＜0.01。

組別 例數(shù) miRNA-21 AFP/(ng·mL-1) AFP-L3/(%)HCC組 101 13.06±4.23a 298.26±96.87a 16.44±5.23a對照組 50 1.26±0.47 17.39±3.12 7.69±2.98 t值 19.631 20.452 10.972 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.2 HCC 不同臨床病理因素患者血清miRNA-21、AFP、AFP-L3 表達(dá)水平比較 HCC組患者血清miRNA-21、AFP、AFP-L3表達(dá)水平與性別、年齡、腫瘤部位無明顯相關(guān)性(均P＞0.05)；與腫瘤直徑、臨床分期、肝功能分級、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、治療明顯相關(guān)，腫瘤直徑＞5 cm、臨床高分期、肝功能C級、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及治療前血清miRNA-21、AFP、AFP-L3表達(dá)水平明顯高于腫瘤直徑≤5 cm、臨床低分期、肝功能A/B級、無轉(zhuǎn)移、無復(fù)發(fā)及治療后血清水平(均P＜0.01)，見表2。

表2 HCC不同臨床病理因素患者血清miRNA-21、AFP、AFP-L3表達(dá)水平比較(±s)

表2 HCC不同臨床病理因素患者血清miRNA-21、AFP、AFP-L3表達(dá)水平比較(±s)

注：組內(nèi)分別比較，bP＞0.05，cP＜0.01。

臨床病理因素 例數(shù) miRNA-21 t值 P值 AFP/(ng·mL-1) t值 P值 AFP-L3/% t值 P值性別 0.708 ＞0.05 1.522 ＞0.05 1.968 ＞0.05男58 13.34±4.15b 312.54±101.36b 17.32±5.73b女43 12.68±5.21 281.33±95.47 15.27±4.31年齡/歲 0.544 ＞0.05 1.277 ＞0.05 1.723 ＞0.05≤60 45 12.77±3.79b 284.59±102.33b 15.34±5.06b＞60 56 13.29±5.44 309.25±98.76 17.32±6.23腫瘤發(fā)生部位 1.901 ＞0.05 0.633 ＞0.05 0.702 ＞0.05左肝 53 12.20±5.47b 304 48 14.01±3.87 291 5.467 ＜0.01 40 10.06±2.32 210 61 15.23±5.67c 356 11.172 ＜0.01 60 8.35±3.12 211 41 20.13±7.26c 413.52±110.35b 16.03±6.57b右肝 .35±97.62 16.89±5.64腫瘤直徑/cm 6.942 ＜0.01 4.481 ＜0.01≤5 .34±79.35 13.01±4.37＞5 .28±116.32c 18.69±7.21c臨床分期 9.168 ＜0.01 10.123 ＜0.01Ⅰ+Ⅱ .16±65.19 10.82±4.21Ⅲ+Ⅳ .62±152.13c 24.67±9.32c肝功能分級 9.506 ＜0.01 10.213 ＜0.01 9.061 ＜0.01 A級+B級 79 10.53±3.97 221.16±75.23 12.11±4.69 C級 22 22.13±7.89c 465.27±159.34c 25.79±10.16c淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 8.673 ＜0.01 3.431 ＜0.01 4.687 ＜0.01無36 7.36±2.88 248.22±73.61 12.13±4.66有65 16.23±5.74c 326.29±125.63c 18.67±7.21c遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移 9.441 ＜0.01 10.523 ＜0.01 8.565 ＜0.01無82 10.71±4.03 254.16±77.65 13.62±5.17有19 23.19±8.67c 532.69±179.82c 28.37±11.46c復(fù)發(fā) 14.470 ＜0.01 13.452 ＜0.01 8.290 ＜0.01無80 10.53±4.12 222.14±82.43 13.49±4.89有21 22.69±6.64c 596.33±192.14c 27.69±12.13c治療 22.231 ＜0.01 27.106 ＜0.01 14.335 ＜0.01前101 13.06±4.23c 298.26±96.87c 16.44±5.23c后101 3.27±1.32 35.27±5.69 7.23±3.79

2.3 血清miRNA-21、AFP、AFP-L3水平對HCC患者預(yù)后的影響 隨訪3年，HCC患者血清腫瘤標(biāo)志物高水平表達(dá)組(miRNA-21＞18.13、AFP＞432.15 ng/mL、AFP-L3＞23.86%) 無事件發(fā)生率明顯低于低水平表 達(dá) 組(miRNA-21 ≤18.13、AFP ≤432.15 ng/mL、AFP-L3≤23.86%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2＝11.867、18.929、9.666，P＝0.001、＜0.001、0.002)，P＜0.01，見圖1～3。

圖1 血清miRNA-21水平與HCC治療后3年生存狀況關(guān)系

圖2 血清AFP 水平與HCC治療后3年生存狀況關(guān)系

圖3 血清AFP-L3水平與HCC治療后3年生存狀況關(guān)系

2.4 血清miRNA-21、AFP、AFP-L3三項(xiàng)聯(lián)合檢測

診斷HCC的價值比較 繪制ROC曲線求取血清miRNA-21、AFP、AFP-L3 診斷HCC臨界值。血清miRNA-21、AFP、AFP-L3 診斷HCC的曲線下面積(AUC)分別為0.869(95%CI：0.761，0.892)、0.789(95%CI：0.717，0.860)、0.763(95%CI：0.695，0.843)；約登指數(shù)分別為0.776、0.654、0.603；診斷HCC臨界 值 分 別 為miRNA-21：2.78，AFP：22.69 ng/mL，AFP-L3：10.98%。

血 清miRNA-21、AFP、AFP-L3 診 斷HCC實(shí) 驗(yàn)室結(jié)果與病理診斷結(jié)果對照，見表3；以病理診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，血清miRNA-21、AFP、AFP-L3單項(xiàng)及聯(lián)合檢測診斷HCC價值，見表4。血清miRNA-21、AFP、AFP-L3三項(xiàng)聯(lián)合檢測診斷HCC的敏感性、準(zhǔn)確性、陰性預(yù)測值與各單項(xiàng)及兩兩組合比較明顯提高(P＜0.01)。

表3 血清miRNA-21、AFP、AFP-L3診斷HCC實(shí)驗(yàn)室結(jié)果與病理診斷結(jié)果對照(n)

表4 血清miRNA-21、AFP、AFP-L3單項(xiàng)及聯(lián)合檢測診斷HCC的價值比較 單位：%

3 討論

血清腫瘤標(biāo)志物檢測是具有標(biāo)本采集方便、可定量及動態(tài)測定等特點(diǎn)的一項(xiàng)無創(chuàng)性篩查惡性腫瘤的體外診斷實(shí)驗(yàn)[9]。相關(guān)研究報道[10]，血清腫瘤標(biāo)志物在惡性腫瘤早期就有升高現(xiàn)象，往往比影像學(xué)改變及患者出現(xiàn)臨床癥狀提前4～6個月，其檢測適合惡性腫瘤高危人群篩查、早期診斷及預(yù)后隨訪[11]。由于惡性腫瘤基因及發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性，一種惡性腫瘤可以產(chǎn)生多種與之相關(guān)的標(biāo)志物，或一種標(biāo)志物可以在多種惡性腫瘤表達(dá)，它們的敏感性、特異性不盡相同，有選擇的數(shù)種標(biāo)志物聯(lián)合檢測，可有效提高診斷惡性腫瘤的準(zhǔn)確性[12]。miRNA-21、AFP、AFP-L3等與HCC發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，它們都可作為HCC診斷的生物學(xué)指標(biāo)。

多種惡性腫瘤如肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌等發(fā)生發(fā)展與miRNAs密切相關(guān)，miRNA在其過程中通過對蛋白編碼基因的調(diào)控發(fā)揮類似抑癌基因或癌基因的作用[6]。miRNA-21 作為miRNAs 一員，其在HCC的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移、免疫調(diào)控等多方面發(fā)揮著重要生物學(xué)作用[13]。miRNA-21作為癌基因促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，在HCC早期血清miRNA-21升高現(xiàn)象比AFP明顯，可以作為診斷HCC 早期診斷的預(yù)警標(biāo)志物[14]。外周血miRNA-21水平與HCC的生物學(xué)行為如腫瘤大小、肝功能分級、臨床分期、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等高度相關(guān)，有效治療后隨著瘤體負(fù)荷減少或瘤體消失，血清miRNA-21水平與治療前比較明顯下調(diào)，可以作為監(jiān)控預(yù)后的指標(biāo)[7]。AFP是一種糖蛋白，由妊娠期胎兒肝臟和卵黃囊產(chǎn)生的，出生后外周血含量一般小于20 ng/mL[15]。當(dāng)肝組織細(xì)胞發(fā)生癌變時，肝癌細(xì)胞內(nèi)AFP合成基因被激活而大量產(chǎn)生和分泌AFP，釋放到外周血液中，外周血液含量增高，甚至超過1 000 ng/mL[16]。我國《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范》 要求AFP作為原發(fā)性肝癌篩查、診療中必查的血清學(xué)指標(biāo)[8]。高濃度AFP抑制機(jī)體正常免疫應(yīng)答，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲[17]。AFP-L3稱為AFP異質(zhì)體，為肝癌細(xì)胞特有產(chǎn)生，一般以AFP-L3%代表血清表達(dá)量，AFP-L3%是指AFP-L3 占AFP 總量的百分比，AFP-L3%是HCC生物學(xué)惡性程度的一個標(biāo)志[18]。2005年美國FDA把AFP-L3%≥10%作為肝癌的預(yù)警臨界值，如果患者血清AFP-L3%≥10%提示罹 患HCC 的 可 能 性 很 大[19]。 早 期HCC 血 清AFP-L3%出現(xiàn)升高現(xiàn)象要早于影像學(xué)改變，因此AFP-L3%的測定對HCC的早期診斷具有重要意義，如果術(shù)后AFP-L3%水平變化不明顯，提示癌組織有殘留[20]。

本研究結(jié)果顯示，HCC組患者血清miRNA-21、AFP、AFP-L3水平明顯高于對照組(P＜0.01)；腫瘤直徑≥5 cm、臨床高分期、肝功能C級、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、治療前血清miRNA-21、AFP、AFP-L3水平明顯高于腫瘤直徑≤5 cm、臨床低分期、肝功能A/B級、無轉(zhuǎn)移、無復(fù)發(fā)、治療后血清水平(均P＜0.01)。雖然miRNA-21、AFP、AFP-L3都可以作為診斷HCC血清學(xué)指標(biāo)，但單獨(dú)性檢測價值有限，血清miRNA-21、AFP、AFP-L3聯(lián)合檢測做到相互印證、相互補(bǔ)充，診斷HCC敏感性、準(zhǔn)確性明顯提高，從而減少誤診、漏診；依據(jù)生存曲線評估預(yù)后。

綜上所述，血清miRNA-21、AFP、AFP-L3三項(xiàng)聯(lián)合檢測有利于HCC早期診斷、監(jiān)控病情及預(yù)后評估。