金倩倩，劉理燕，汪 洋，蔣良夢，孫 佳，鄭 林，王永林，△

（1.貴州醫(yī)科大學民族藥與中藥開發(fā)應用教育部工程研究中心·省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學藥學院，貴州 貴陽 550004；3.貴州醫(yī)科大學貴州省藥物制劑重點實驗室，貴州 貴陽 550004）

土一枝蒿為菊科植物云南蓍Achillea wilsonianaHeimerl ex Hand.-Mazz.新鮮或干燥的地上部分，又名飛天蜈蚣、野一枝蒿等，主要產(chǎn)于云南、四川、貴州等地，具有解毒利濕、活血止痛等功效，可用于頭風痛、牙痛、風濕痹痛、血瘀經(jīng)閉、腹部痞塊、跌撲損傷、蛇蟲咬傷、癰腫瘡毒等的治療[1-3］。土一枝蒿是貴州省少數(shù)民族用藥，收載于《貴州省中藥材、民族藥材質量標準》（2003年版），其中僅對其性狀及顯微特征進行了規(guī)定[4］，相關文獻也較缺乏。因此，本研究中參照2020年版《中國藥典（四部）》對土一枝蒿藥材水分、總灰分、水溶性浸出物進行含量測定，并通過高效液相色譜（HPLC）法對不同產(chǎn)地和批次的土一枝蒿藥材進行指紋圖譜研究及3種主要成分的含量測定，以期為其質量標準研究提供參考。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Ultimate3000型高效液相色譜儀（美國Thermo Fisher Scientific公司），包括Chromeleon色譜數(shù)據(jù)工作站、系統(tǒng)控制器、柱溫箱、低壓梯度組件、輸液泵、脫氣組件、樣品室、自動進樣器、UV-DAD檢測器；AE240型十萬分之一電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；KQ5200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

異葒草素對照品、異牡荊苷對照品、槲皮素-4'-O-β-D-葡萄糖苷對照品（均為從土一枝蒿藥材中提取分離制備所得，含量均大于98.0%）；乙腈為色譜純；其余試劑為分析純；水為超純水。土一枝蒿藥材12批（來源及批號見表1），經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學藥學院生藥實驗室孫慶文教授鑒定為菊科蓍屬植物土一枝蒿的干燥全草。

表1 藥材樣品來源Tab.1 Source information of Achillea wilsoniana samples

2 方法與結果

2.1 水分、灰分、浸出物含量測定

參照2020年版《中國藥典（四部）》通則0832水分測定法中的第二法（烘干法）、通則2302灰分測定法和通則2201項下水溶性浸出物測定法進行相應含量測定。結果見表2。

表2 藥材樣品水分、總灰分、水溶性浸出物含量測定結果（%，n=2）Tab.2 Results of content determination of moisture，total ash and water-soluble extract of Achillea wilsoniana samples（%，n=2）

2.2 HPLC指紋圖譜的建立與分析

2.2.1 色譜條件

色譜柱：CAPCELLPAKC18MGⅡ（S-5）柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～45 min時13%A，45～46 min時13%A→14%A，46～76 min時14%A，76～77 min時14%A→15%A，77～107min時15%A→20%A，107～113min時20%A→65%A）；流速：0.7 mL/min；檢測波長：365 nm；柱溫：30℃；進樣量：10μL。

2.2.2 溶液制備

取異葒草素、異牡荊苷、槲皮素-4'-O-β-D-葡萄糖苷對照品各適量，精密稱定，用甲醇溶解制成質量濃度分別為1.101，1.580，1.346 mg/mL的單一對照品貯備液；分別精密量取12.5，5，5 mL，置同一25 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得質量濃度分別為0.550 5，0.316 0，0.269 2 mg/mL的混合對照品溶液。取藥材樣品粉末1.0 g，過3號篩，精密稱定，置50 mL具塞三角瓶中，精密加入70%甲醇20 mL，稱定質量，超聲（功率200 W，頻率40 kHz）處理15 min，放冷至室溫，再次稱定質量，加70%甲醇補足減失的質量，搖勻，靜置，取上層液，12 000 r/min離心10 min，取上清液，即得供試品溶液。以甲醇為空白對照溶液。

2.2.3 方法學考察

精密度試驗：取藥材樣品（編號S1）適量，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，以異紅草素峰（5號峰）為參照峰，計算14個共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結果的RSD分別小于0.50%，3.00%（n=6），表明方法精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取2.2.2項下供試品溶液（編號S1），分別于室溫下放置0，4，8，18，20，24 h時按2.2.1項下色譜條件進樣測定，以異紅草素峰（5號峰）為參照峰，計算14個共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結果的RSD分別小于0.50%，3.00%（n=6），表明供試品溶液在室溫放置24 h內基本穩(wěn)定。

重復性試驗：取藥材樣品（編號S1）適量，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，平行6份，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，以異紅草素峰（5號峰）為參照峰，計算14個共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結果的RSD分別小于1.00%，2.00%（n=6），表明方法重復性良好。

2.2.4 指紋圖譜建立與相似度評價

指紋圖譜建立：取10批藥材樣品各適量，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，將10批藥材樣品的HPLC數(shù)據(jù)導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012年130723版），利用中位數(shù)法進行多點校正，生成10批藥材樣品的HPLC疊加指紋圖譜（圖1）及共有模式的對照指紋圖譜（圖2），共確定了14個共有峰。通過與混合對照品溶液圖譜（圖3）比對，確認5號峰為異葒草素，10號峰為異牡荊苷，12號峰為槲皮素-4'-O-β-D-葡萄糖苷。

圖1 10批藥材樣品高效液相色譜疊加指紋圖譜Fig.1 Superimposed HPLC fingerprints of 10 batches of Achillea wilsoniana samples

圖2 高效液相色譜對照指紋圖譜Fig.2 HPLC reference fingerprint

圖3 混合對照品溶液高效液相色譜圖5.Isoorientin 10.Isovitexin 12.Quercetin-4'-O-β-D-glucosideFig.3 HPLC chromatogram of mixed reference solution

相似度評價：以共有模式為對照圖譜，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012年130723版）計算10批樣品的相似度。結果S1～S10藥材樣品相似度依次為0.987，0.997，0.957，0.986，0.941，0.995，0.987，0.995，0.993，0.988，表明不同產(chǎn)地、不同批次樣品的相似度較好。

2.3 含量測定

2.3.1 方法學考察

系統(tǒng)適用性試驗：取2.2.2項下混合對照品溶液、供試品溶液、空白對照溶液適量，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果供試品溶液中異葒草素、異牡荊苷、槲皮素-4'-O-β-D-葡萄糖苷色譜峰保留時間與對照品色譜峰一致，各成分分離度均大于1.5，理論板數(shù)均大于15 000，且空白對照無干擾。詳見圖4。

圖4 高效液相色譜圖1.Isoorientin 2.Isovitexin 3.Quercetin-4'-O-β-D-glucoside A.Mixed reference solution B.Test solution C.Blank control solutionFig.4 HPLC chromatograms

線性關系考察：精密量取2.2.2項下混合對照品溶液適量，逐級稀釋成不同質量濃度的系列混合對照品溶液，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以待測成分質量濃度（X，mg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程，異葒草素為Y1=402.56X1+0.230 5（r=0.999 9）、異牡荊苷為Y2=303.68X2+1.314 5（r=0.999 5）、槲皮素-4'-O-β-D-葡萄糖苷為Y3=309.48X3+0.102 0（r=0.999 8）。結果表明，異葒草素、異牡荊苷、槲皮素-4'-O-β-D-葡萄糖苷質量濃度分別在12.55～200.82μg/mL、7.20～115.28μg/mL、6.14～98.20μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：取樣品（編號S1）適量，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結果異葒草素、異牡荊苷、槲皮素-4'-O-β-D-葡萄糖苷峰面積的RSD分別為0.82%，0.81%，2.12%（n=6），表明方法精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取2.2.2項下供試品溶液（編號S1），分別于室溫下放置0，4，8，18，20，24 h時按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果異葒草素、異牡荊苷、槲皮素-4'-O-β-D-葡萄糖苷峰面積的RSD分別為0.54%，0.67%，2.05%（n=6），表明供試品溶液在室溫放置24 h內基本穩(wěn)定。

重復性試驗：取藥材樣品（編號S1）適量，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，平行6份，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果異葒草素、異牡荊苷、槲皮素-4'-O-β-D-葡萄糖苷峰面積的RSD分別為1.78%，1.95%，2.24%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量藥材樣品粉末（編號S1）約0.5 g，精密稱定，各6份，分別加入異葒草素、異牡荊苷、槲皮素-4'-O-β-D-葡萄糖苷對照品0.741 5，0.254 3，0.182 5 mg，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率。結果見表3。

表3 加樣回收試驗結果（n=6）Tab.3 Results of the recovery test（n=6）

2.3.2 藥材樣品含量測定

取各批藥材樣品粉末約1.0g，精密稱定，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按標準曲線法計算樣品中3種待測成分含量。結果見表4。

表4 藥材樣品含量測定結果（mg/g，n=2）Tab.4 Results of the content determination of three components in 10 batches of Achillea wilsoniana samples（mg/g，n=2）

3 討論

3.1 樣品提取方法選擇

預試驗中分別考察了提取溶劑（30%甲醇、70%甲醇、甲醇、30%乙醇、70%乙醇、乙醇、水）、提取時間（15，30，45 min）、提取方式（超聲、回流）對提取效果的影響，在考慮供試品制備方法的高效、簡單、方便操作等因素前提下最終確定，提取溶劑為70%甲醇、超聲處理15 min為最佳提取方法。

3.2 色譜條件優(yōu)化

預試驗中對不同檢測波長進行了考察，發(fā)現(xiàn)各待測成分在330，350，365 nm波長處有較大吸收，但在330，350 nm波長處有雜質峰干擾，且基線分離效果不如365 nm，故最終選擇365 nm為檢測波長；比較了不同色譜柱的分離效果，發(fā)現(xiàn)MGⅡC18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）具有較高柱效，能較好地分離待測成分與雜質峰；流動相考察了乙腈-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液、甲醇-水、乙腈-水，發(fā)現(xiàn)以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相時，各色譜峰的峰形及分離度較好；還考察了不同柱溫（30℃、35℃、40℃）及流速（0.7，0.8，1.0 mL/min），發(fā)現(xiàn)30℃為分析檢測的最佳柱溫，流速為0.7 mL/min時色譜峰分離效果優(yōu)于0.8 mL/min及1.0 mL/min，故可確定最佳色譜條件。

3.3 結果分析

有文獻報道，土一枝蒿藥材中主要含有萜烯類，生物堿類等化學成分，具有抗炎、解熱、鎮(zhèn)痛、抗菌、血管保護等藥用價值[5-13］。國內外文獻尚未見其質量控制相關研究報道，在《貴州省中藥材、民族藥材質量標準》（2003年版）中僅以土一枝蒿藥材的性狀及顯微鑒別作為質量控制指標，不能全面控制藥材的質量。因此，本試驗中對土一枝蒿藥材進行了指紋圖譜及含量測定的研究，結果表明，10批不同產(chǎn)地和不同批次土一枝蒿藥材相似度均大于0.940，說明貴州省內各產(chǎn)地的藥材質量均一性較高。水分與浸出物含量相對總灰分含量而言差異較小，范圍較寬，說明貴州省不同產(chǎn)地的土一枝蒿藥材中無機成分、雜質、泥沙含量差異較大。不同產(chǎn)地的樣品含量存在差異，其中S4樣品中異葒草素、異牡荊苷、槲皮素-4'-O-β-D-葡萄糖苷含量較低，S5樣品含量較高，除這兩批藥材外，其余8批土一枝蒿藥材中3種成分含量較均衡。由以上結果可知，藥材成分含量差異與產(chǎn)地的差異有一定相關性。

綜上所述，本研究中建立的HPLC指紋圖譜及含量測定的方法簡單，準確可靠，樣品的收集具有一定代表性，可為土一枝蒿藥材的質量控制提供參考。