陳鵬莉 宋紫微 張曼玉 李麗麗

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院心內(nèi)科,黑龍江 哈爾濱 150081)

心肌梗死是臨床上常見(jiàn)的心血管疾病,雖然心肌梗死的治療在不斷地發(fā)展與完善,但心肌梗死后的并發(fā)癥仍是心血管疾病死亡的主要原因。目前,干細(xì)胞移植已被證實(shí)可改善心功能,并且主要是通過(guò)旁分泌途徑起作用。但由于干細(xì)胞移植存在倫理、安全和致瘤等問(wèn)題,使其在臨床應(yīng)用上受到限制[1]。目前研究認(rèn)為外泌體含有大量的蛋白質(zhì)和非編碼RNA,可傳遞至心臟改善心功能[2]。現(xiàn)重點(diǎn)介紹和討論基于干細(xì)胞來(lái)源的外泌體微RNA(microRNA,miRNA)修復(fù)受損心臟的機(jī)制及當(dāng)前治療進(jìn)展,有望為心血管疾病臨床診療提供有效的新靶點(diǎn)和治療方法。

1 外泌體

1.1 外泌體特征

外泌體是一種直徑為40～160 nm、具有脂質(zhì)雙分子膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞分泌型囊泡[3],幾乎可被所有類型的細(xì)胞分泌。外泌體最早是在顯微鏡下觀察到的培養(yǎng)細(xì)胞脫落的具有酶活性的囊泡[4]。隨著研究的深入,人們發(fā)現(xiàn)這種囊泡攜帶豐富的物質(zhì),包括核酸[信使RNA(messenger RNA,mRNA)、miRNA和DNA等]、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和遺傳因子。到目前為止,ExoCarta exosome數(shù)據(jù)庫(kù)收集了9 769種蛋白質(zhì)、3 408個(gè)mRNA、2 838個(gè)miRNA和1 116種脂質(zhì)體[5]。外泌體表面有大量的跨膜蛋白及細(xì)胞黏附分子,可與靶細(xì)胞結(jié)合及穿透靶細(xì)胞膜[6]。

1.2 miRNA

非編碼RNA是包含大多數(shù)人類轉(zhuǎn)錄組的功能性RNA,大約1.5%的人類基因組被轉(zhuǎn)錄成mRNA。在非編碼RNA中,miRNA被廣泛研究,它是一類由內(nèi)源性、保守的21～23個(gè)核苷酸組成的單鏈非編碼RNA。miRNA絕大多數(shù)與靶mRNA的3’非翻譯區(qū)結(jié)合,抑制mRNA翻譯來(lái)調(diào)節(jié)特定基因表達(dá)[7]。此外,miRNA還具有超出常規(guī)的調(diào)節(jié)功能,通過(guò)調(diào)控轉(zhuǎn)錄和核內(nèi)基因啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的表觀遺傳狀態(tài),以及靶向線粒體編碼轉(zhuǎn)錄物,影響基因表達(dá)[8]。

2 外泌體介導(dǎo)心臟修復(fù)的機(jī)制

心臟內(nèi)穩(wěn)態(tài)是通過(guò)細(xì)胞間的復(fù)雜相互作用網(wǎng)絡(luò)實(shí)現(xiàn)的,包括血管內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和炎癥細(xì)胞等,心臟受損后,穩(wěn)態(tài)被破壞造成心臟適應(yīng)性不良重構(gòu),而干細(xì)胞來(lái)源的外泌體可以靶向這些細(xì)胞減少病理性重構(gòu)。以下將分別闡述外泌體修復(fù)受損心臟的過(guò)程。

2.1 內(nèi)皮細(xì)胞

外泌體被證實(shí)攜帶miRNA作用于靶組織,調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能和血管生成[7]。Wu等[9]報(bào)告在小鼠心肌梗死模型中,人多能干細(xì)胞來(lái)源的外泌體通過(guò)將外泌體內(nèi)的miR-497攜帶入內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi),促進(jìn)血管生成。Zhu等[10]發(fā)現(xiàn)脂肪干細(xì)胞的外泌體通過(guò)輸送靶向缺氧誘導(dǎo)因子1的miR-31促進(jìn)了小鼠心臟的血管生成,這有利于心肌梗死后心臟修復(fù)。另外,在大鼠脂肪干細(xì)胞外泌體中篩選出miR-196a-5p和miR-425-5p,在缺氧環(huán)境下促進(jìn)血管內(nèi)皮生成,機(jī)制可能與靶向血管生成相關(guān)的Spred1、SEPT7和PDGFRA基因有關(guān)[11]。以上研究表明在心臟損傷時(shí),外泌體可通過(guò)改善血管內(nèi)皮細(xì)胞導(dǎo)致心臟新血管生成,進(jìn)而促進(jìn)心臟修復(fù)。

2.2 心肌細(xì)胞

心肌細(xì)胞是心臟的主要細(xì)胞,缺血30 min以上心肌細(xì)胞發(fā)生水腫和結(jié)構(gòu)改變,出現(xiàn)進(jìn)行性死亡,心肌細(xì)胞減少,最終導(dǎo)致心力衰竭。已有研究證實(shí),人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞外泌體通過(guò)向心肌細(xì)胞內(nèi)傳遞心臟保護(hù)性miRNA如miR-21[12]和miR-210[13],可減輕心肌細(xì)胞的損傷。此外,在豬的心肌梗死模型中,來(lái)自人誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞外泌體可減輕心臟肥大并改善心臟功能[14]。Song等[15]的研究發(fā)現(xiàn)攜帶具有抗凋亡作用的miR-21的細(xì)胞外囊泡轉(zhuǎn)移至心肌細(xì)胞后,可通過(guò)降低程序性細(xì)胞死亡因子4的表達(dá),減少心肌細(xì)胞凋亡。

既往認(rèn)為成年心肌細(xì)胞不具有分化再生能力,但是近年來(lái)通過(guò)心肌細(xì)胞譜系追蹤和同位素標(biāo)記分析表明,心肌細(xì)胞具有很弱的增殖能力,可通過(guò)自我增殖而再生[16]。使用全基因組miRNA文庫(kù)篩選出誘導(dǎo)心臟再生潛力hsa-miR-199a[17],Gabisonia等[18]將AAV6-miR-199a注射到心肌梗死后豬的左心室室壁,通過(guò)刺激去分化和增殖,另外心臟內(nèi)注射miR-19a/19b模擬物可增強(qiáng)心肌細(xì)胞增殖并刺激心肌再生以減少心肌損傷[19],這種轉(zhuǎn)染療法可通過(guò)脂質(zhì)體,或包裹在脂質(zhì)或聚合物納米顆粒中進(jìn)行,另一種可能性是利用外泌體優(yōu)先裝載核酸,但這項(xiàng)技術(shù)還不成熟,可能成為進(jìn)一步發(fā)展的途徑。

2.3 成纖維細(xì)胞

心肌梗死時(shí),壞死區(qū)域需要瘢痕沉積防止心臟破裂并限制功能惡化,然而過(guò)度的纖維化會(huì)破壞正常的結(jié)構(gòu),最終導(dǎo)致心力衰竭[20]。含有miR-24的間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體可能通過(guò)抑制抗增殖蛋白2和線粒體自噬途徑降低成纖維細(xì)胞的遷移和增殖能力,從而減輕心肌纖維化[21]。Sun等[22]在心肌梗死模型中將過(guò)表達(dá)miR-221-3p外泌體注射到梗死邊界區(qū),觀察到心肌纖維化減輕。此外,miR-222也被證實(shí)通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin介導(dǎo)的內(nèi)皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化,改善糖尿病小鼠心臟的心肌纖維化[23]。由此可見(jiàn),外泌體可通過(guò)miRNA介導(dǎo)細(xì)胞間通信,通過(guò)抗心肌纖維化促進(jìn)心臟修復(fù)。

2.4 炎癥細(xì)胞

心肌梗死后壞死的心肌細(xì)胞釋放各種細(xì)胞因子以誘導(dǎo)炎癥反應(yīng),在心肌缺血早期,炎癥反應(yīng)會(huì)清除壞死的心肌細(xì)胞和碎片[24]。攜帶miR-223-3p的間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞外囊泡調(diào)節(jié)樹突細(xì)胞成熟并促進(jìn)其抗炎潛力[25],Zhao等[26]發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源外泌體(mesenchymal stem cell-derived exosome,MSC-Exo)通過(guò)miR-182改變巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài),減輕小鼠心肌缺血再灌注損傷。MSC-Exo還被證實(shí)通過(guò)miR-181a影響JAK1-STAT1/c-Fos信號(hào)通路,減弱樹突細(xì)胞的免疫炎癥反應(yīng),并保護(hù)心肌細(xì)胞在缺氧條件下免于細(xì)胞死亡[27]。Xu等[28]研究經(jīng)脂多糖誘導(dǎo)的骨髓MSC-Exo可通過(guò)抑制核因子-κB信號(hào)通路及部分激活了Akt1/Akt2信號(hào)通路,影響巨噬細(xì)胞亞型的轉(zhuǎn)化來(lái)減輕炎癥。這些研究結(jié)果表明外泌體miRNA參與心肌損傷時(shí)的炎癥反應(yīng)。

3 治療

外泌體具有免疫原性低、生物降解性低、毒性低等優(yōu)點(diǎn),但外泌體的臨床轉(zhuǎn)化面臨著大量生產(chǎn)、標(biāo)準(zhǔn)分離、藥物裝載、穩(wěn)定性和質(zhì)量控制等諸多問(wèn)題[29-30]。目前已提出一系列新策略,例如修飾基因表達(dá)和改善心臟特異性攝取,提高外泌體的治療效率。

3.1 外泌體的基因修飾與化學(xué)修飾

為了將治療性外泌體運(yùn)送到靶細(xì)胞或組織,可采用被動(dòng)或主動(dòng)的靶向策略,被動(dòng)靶向利用外泌體的自然細(xì)胞趨向性,而主動(dòng)靶向則通過(guò)各種技術(shù)手段靶向輸送。Li等[31]構(gòu)建CD9-HuR融合蛋白,富集miR-155的特定RNA,識(shí)別內(nèi)源靶標(biāo)在受體細(xì)胞中起作用。Wang等[32]利用設(shè)計(jì)了與缺血心肌靶向肽融合的外泌體富集膜蛋白,可特異性靶向缺血心肌。Vandergriff等[33]利用心臟歸巢肽與外泌體結(jié)合靶向梗死心肌,有研究[34]將組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑2修飾人臍帶血MSC-Exo,通過(guò)激活A(yù)kt/Sfrp2通路減輕心肌梗死誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)改善心功能。外泌體通過(guò)CRISPR/Cas9修飾技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)靶目標(biāo)的基因編輯,而且開發(fā)了一種光觸發(fā)脂質(zhì)體遞送系統(tǒng),通過(guò)690 nm LED光束照射組織表面,使CRISPR/Cas9基因編輯獲得高度的空間和時(shí)間控制[35]。

3.2 外泌體包裝

近年來(lái),人工外泌體更具有藥物可接受性,經(jīng)過(guò)化學(xué)改良,采用薄膜水合法分組的濕化學(xué)方法用于多層囊泡的合成是最經(jīng)典的。Hammons等[36]使用薄膜水合方法將二油酰基磷脂酰膽堿和聚氧乙烯溶解在氯仿中,經(jīng)過(guò)水合、去膜制備混合仿生囊泡。為了在體內(nèi)將外泌體精確遞送到受體細(xì)胞,模擬單核細(xì)胞募集特征,Zhang等[37]獲得了從巨噬細(xì)胞分離的單核細(xì)胞膜,然后與來(lái)自間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞外囊泡通過(guò)融合獲得單核細(xì)胞模擬的間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞外囊泡,增強(qiáng)缺血再灌注損傷后的心臟修復(fù)。Zhao等[38]將外泌體封裝在海藻酸鈉-鹽水凝膠中,以促進(jìn)心肌等組織的血管生成。Zhu等[39]在心肌梗死的動(dòng)物模型中,通過(guò)微創(chuàng)心包內(nèi)注射含有干細(xì)胞源性外泌體的水凝膠,可減輕免疫反應(yīng)并增加藥物在心臟滯留。另外,將外泌體與血小板膜混合[40],利用生物材料的微創(chuàng)外泌體噴霧劑[41]等新技術(shù)可以靶向受損心臟,發(fā)揮促進(jìn)心臟修復(fù)的作用。

4 總結(jié)與展望

綜上所述,外泌體攜帶來(lái)自其原始細(xì)胞的選擇性生物分子并將其傳遞給受體細(xì)胞促進(jìn)心臟修復(fù)。外泌體代表一種有前途的無(wú)細(xì)胞治療,無(wú)生命但具有生物活性的外泌體在心臟受損時(shí)發(fā)揮獨(dú)特作用,并且通過(guò)體外培養(yǎng)的方式,方便作為藥物制劑提供給藥,這可能潛在地應(yīng)用于心血管疾病治療。

上述研究強(qiáng)調(diào)了外泌體用于心血管疾病治療的機(jī)制及治療進(jìn)展,但心臟修復(fù)方法仍局限于臨床前水平,小動(dòng)物實(shí)驗(yàn)主要揭示特定分子機(jī)制,而大型動(dòng)物更適合建立在涉及混雜因素的研究,來(lái)自心肌梗死的大型臨床前模型的數(shù)據(jù)仍然缺乏。目前外泌體的研究處于起步階段,在臨床應(yīng)用中面臨很多挑戰(zhàn),未來(lái)仍需做更深入研究。