張 賽，鄭凌琦，沈正東，徐江喜，張玉婷，劉小平，侯秀娟，朱躍蘭*

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院風(fēng)濕科，北京 100078）

干燥綜合征（Sj?gren's syndrome,SS）是一種侵犯唾液腺、淚腺為主的全身外分泌腺體的慢性炎癥性自身免疫病，以口干、眼干、猖獗齒、反復(fù)發(fā)生的腮腺炎等為主要臨床表現(xiàn)。本病90%以上病人為女性，多見于30～50歲，我國人群患病率約為0.29%～0.77%[1]。目前認(rèn)為，SS 的觸發(fā)與遺傳、環(huán)境因素等相關(guān)，而免疫系統(tǒng)的紊亂與T、B 淋巴細(xì)胞異常激活、水通道蛋白5（aquaporins 5,AQP5）異常轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)[2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，外分泌腺細(xì)胞的凋亡亦是本病早期病理變化之一，上皮細(xì)胞凋亡水平可誘導(dǎo)pSS 樣自身免疫病的發(fā)生和抗SSA 和（或）抗SSB 抗體的生成，且可誘導(dǎo)自身免疫性淋巴細(xì)胞的浸潤[3]。本研究擬從細(xì)胞分子生物學(xué)角度，以人頜下腺（human submandibular gland cells,HSG）細(xì)胞為研究對(duì)象，以TRAIL+INF-γ 誘導(dǎo)凋亡，模擬SS 細(xì)胞凋亡微環(huán)境，探討活血解毒方對(duì)HSG 細(xì)胞凋亡及炎癥因子表達(dá)的影響，進(jìn)一步豐富該方治療SS 的生物學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞 本實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞為HSG 細(xì)胞，購自廣州吉妮歐生物科技有限公司，細(xì)胞來源歐洲細(xì)胞株保存庫（European collection of Authenticated cell cultures,ECACC），貼壁生長，培養(yǎng)條件為90%DMEM 加10%FBS，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，本實(shí)驗(yàn)選用第4 代細(xì)胞。

1.2 藥物 中藥活血解毒方由丹參30 g，玄參20 g，連翹15 g，川芎15 g，雞血藤20 g，炒白芍30 g，生地黃30 g，麥門冬20 g，石斛10 g，南北沙參各15 g，甘草10 g 組成。（以上飲片均購于北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院中藥房）；白芍總苷膠囊（寧波立華制藥有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字H20055058）。將上述中藥復(fù)方（四劑1 000 g）浸泡1 h，第一煎10 倍水至少煎1 h，第二煎8 倍水至少煎40 min，最終得1 000 mL 藥汁。機(jī)器型號(hào)：LGJ-10B 冷凍干燥機(jī)，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)儀器研制，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司制造。冷阱溫度：-45 ℃。真空：1.0。將樣品-20 ℃下預(yù)凍2 h，將樣品置于冷凍干燥機(jī)中，冷凍干燥48 h 后取出樣品即得。

1.3 試劑與耗材 Annexin V-APC/7-AAD 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（中國 江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司 KGA1024）；Mouse-anti-FAS（武漢三鷹 60196-1-IG）；Rabbit -anti-FAS-L（Bioss bs-0216R）；Rabbitanti-Cytochrome（武漢三鷹 10993-1-AP）；MaxVision試劑盒(鼠）（中國 福州邁新生物科技有限公司 KIT-5002）；MaxVision 試劑盒(兔）（中國 福州邁新生物科技有限公司 KIT-5005）；DAB Kit（中國 福州邁新生物科技有限公司DAB-1031）；人IL-1β ELISA 檢測(cè)試劑盒（Proteintech KE00021）；人TNFα ELISA 檢測(cè)試劑盒（Proteintech KE00154）；人IL-6 ELISA 檢測(cè)試劑盒（Proteintech KE00139）等。

1.4 儀器 流式細(xì)胞儀（美國 Becton-Dickinson FACS Calibur）；立式壓力鍋（中國 上海博訊 YXQLS-50）；超凈工作臺(tái)（中國 蘇州凈化 SW-CJ-1FD）；臺(tái)式低速離心機(jī)（中國上海醫(yī)療器械股份有限公司醫(yī)療設(shè)備廠 80-2）；渦旋振蕩器（中國 海門其林貝爾 XW-80A）；紫外光度儀（日本 SHIMADZU UV-2450）；生物熒光顯微鏡（日本 Olympus BX43）；酶標(biāo)儀（美國 MD SpectraMax M3）等。

2 方法

2.1 模型構(gòu)建及分組 將細(xì)胞培養(yǎng)分為空白組、誘導(dǎo)組、對(duì)照組和小、中、大劑量治療組，并計(jì)算各組抑制率，抑制率=[（Ac-As）/（Ac-Ab）]×100%，對(duì)各組進(jìn)行干預(yù)培養(yǎng)時(shí)方法如下：空白組：HSG 細(xì)胞加培養(yǎng)基；模型組：HSG 細(xì)胞加100 ng/mL IFN-γ（20 hrs）加100 ng/mL TRAIL（48hrs）培養(yǎng)基[4]；TGP 組：HSG細(xì)胞加100 ng/mL IFN-γ（20 hrs）加100 ng/mL TRAIL（48 hrs）加白芍總苷（5 μg/mL）培養(yǎng)基；小劑量組：HSG 細(xì) 胞 加100 ng/mL IFN-γ（20 hrs）加100 ng/mL TRAIL（48 hrs）加HXJDD（1.25 μg/mL）中藥凍干粉培養(yǎng)基；中劑量組：HSG 細(xì)胞加100 ng/mL IFN-γ（20 hrs）加100 ng/mL TRAIL（48 hrs）加HXJDD（2.5 μg/mL）中藥凍干粉培養(yǎng)基；大劑量組：HSG 細(xì)胞加100 ng/mL IFN-γ（20 hrs）加100 ng/mL TRAIL（48 hrs）加HXJDD（5 μg/mL）中藥凍干粉培養(yǎng)基。

2.2 Annexin-V APC/7-AAD 雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞消化接種到六孔板中，次日，待細(xì)胞貼壁后，根據(jù)組別設(shè)置加入相應(yīng)的含藥培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組；藥物作用48 h 后，用0.25%胰酶（不含EDTA）消化收集細(xì)胞；用PBS 洗滌細(xì)胞二次（離心1 000 r/min，5 min）收集5×105細(xì)胞；加入500 μL 的Binding Buffer 懸浮細(xì)胞；加入5 μL Annexin V-APC 混勻后，加入5 μL 7-AAD，混勻；室溫、避光、反應(yīng)5～15 min；用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡的情況。

2.3 免疫組化法檢測(cè)蛋白表達(dá) 每張切片滴加2 滴3%H2O2-甲醇溶液，室溫（15～25 ℃）封閉10 min。封閉后滴加一抗50～100 μL，4℃過夜。滴加羊抗兔/鼠聚合物50 μL，室溫濕盒孵育20 min。PBS 浸洗3 min×3 次；每張片子加2 滴新鮮配制的DAB 溶液后終止顯色。復(fù)染后脫水封片，光學(xué)顯微鏡下觀察組織細(xì)胞中蛋白的表達(dá)情況，取3 個(gè)高表達(dá)區(qū)域拍照保存（所有圖片均200×拍攝）。

2.4 ELISA 法檢測(cè)蛋白表達(dá) 稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品50 μL 及待測(cè)樣品孔中準(zhǔn)確加入50 μL。將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。用封板模封板后置37℃溫育90 min。小心揭掉封板模，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s 后棄去，如此重復(fù)5 次，拍干。每孔加入100 μL 生物素化抗體，用封板模封板后置37℃溫育60 min。再次洗滌，每孔加入酶標(biāo)試劑100 μL 后37℃溫育30 min，洗滌后輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15 min，終止反應(yīng)，以450 nm 波長依序測(cè)量各孔的吸光度。

3 結(jié)果

3.1 造模后各組細(xì)胞凋亡情況 見表1。

表1 各組溶液作用于細(xì)胞的凋亡情況

3.2 各組HSG 細(xì)胞凋亡相關(guān)因子蛋白OD 值 免疫組化結(jié)果顯示，模型組、TGP 組、中藥組HSG 細(xì)胞Fas、FasL、Cyt-C 免疫反應(yīng)陽性顆粒數(shù)目增多，呈淺棕色，而空白組HSG 細(xì)胞Fas、FasL、Cyt-C 免疫反應(yīng)陽性顆粒數(shù)目較少，著色淺淡。與空白組相比，模型組Fas、FasL、Cyt-C 蛋白OD 值明顯升高（P＜0.01）；與模型組相比，TGP 組和中藥組Fas、FasL、Cyt-C 蛋白OD 值均明顯降低（P＜0.01）；中藥組與TGP 組相比，F(xiàn)as、FasL 蛋白OD 值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），Cyt-C 蛋白OD 值明顯降低（P＜0.01）。見表2，圖1～3。

圖1 各組細(xì)胞Fas 免疫組化染色（200×）

表2 各組HSG 細(xì)胞Fas、FasL、Cyt-C 蛋白OD 值（± s，n =3）

表2 各組HSG 細(xì)胞Fas、FasL、Cyt-C 蛋白OD 值（± s，n =3）

注：與空白組比較，## P ＜0.01；與模型組比較，△△P ＜0.01；與TGP 組比較，▲▲P ＜0.01

3.3 Elisa 檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6的濃度 見表3。

表3 各組HSG 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6 的濃度比較（± s，n =3）

表3 各組HSG 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6 的濃度比較（± s，n =3）

注：與空白組比較，## P ＜0.01；與模型組比較，△△P ＜0.01；與TGP 組比較，▲▲P ＜0.01

4 討論

干燥綜合征屬中醫(yī)學(xué)“燥痹”范疇。多數(shù)醫(yī)家遵從“燥盛則干”的病機(jī)理論，認(rèn)為本病多因先天稟賦不足或后天調(diào)養(yǎng)失當(dāng)，導(dǎo)致陰津虧虛，清竅失養(yǎng)而發(fā)病。朱躍蘭認(rèn)為燥痹初起即有燥毒存在，津傷日久，燥毒猖獗，邪毒凝集于局部，亦可成血瘀之弊，終成燥瘀毒交雜之勢(shì)[5]。朱躍蘭結(jié)合多年臨床經(jīng)驗(yàn)自擬活血解毒方，用于陰津虧虛、邪毒滯絡(luò)證之燥痹的治療，取得了較好的臨床療效?？v觀活血解毒方方藥組成，在潤燥生津解毒的基礎(chǔ)上，更側(cè)重丹參、雞血藤、川芎等活血化瘀類中藥，以此通過調(diào)節(jié)血液流動(dòng)狀態(tài)祛除瘀滯，從而疏其血?dú)猓钇湔{(diào)達(dá)，最終達(dá)到新物生，腐物消，機(jī)能復(fù)的目的[6]。

圖2 各組細(xì)胞FasL 免疫組化染色（200×）

圖3 各組細(xì)胞Cyt-C 免疫組化染色（200×）

Cyt-c 是存在于線粒體膜間隙的第一個(gè)被鑒定出來最重要的凋亡促進(jìn)因子，是呼吸鏈電子傳遞的物質(zhì)，也是調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要蛋白，當(dāng)受到凋亡刺激后，線粒體膜的通透性改變，促進(jìn)Cyt-C 釋放，凋亡隨即發(fā)生[7]。研究發(fā)現(xiàn)pSS 患者隨著病程的發(fā)展，唇腺組織中Cyt-C的表達(dá)上調(diào)，兩者之間存在相關(guān)性，提示Cyt-C 的改變可能是與病程相關(guān)的連續(xù)進(jìn)展過程相關(guān)[8]。

Fas/Fas L 系統(tǒng)在參與免疫赦免、控制免疫應(yīng)答及誘導(dǎo)被激活的細(xì)胞凋亡、人體自身的耐受機(jī)制中均扮演著重要的角色[9]。Fas 和Fas L 主要分布在自然殺傷細(xì)胞、T 細(xì)胞及生殖細(xì)胞、肝、腎、心中，兩者的結(jié)合可以對(duì)凋亡信號(hào)進(jìn)行傳導(dǎo)，對(duì)Fas 所在細(xì)胞的整個(gè)凋亡過程起誘導(dǎo)作用[10]，外源性的凋亡途徑是通過二者間的相互作用而發(fā)生的。

既往研究發(fā)現(xiàn)SS 患者中TNF-α 的表達(dá)水平顯著高于健康人群，認(rèn)為TNF-α 在SS 發(fā)病發(fā)展過程中起著主要作用[11]。TNF-α 是一種多效性細(xì)胞因子，能調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化、誘發(fā)炎癥并調(diào)控細(xì)胞凋亡，能促進(jìn)B、T 淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體，在炎癥和細(xì)胞凋亡中起著至關(guān)重要的作用。有研究表明，TNF-α 誘導(dǎo)的基質(zhì)金屬蛋白酶9 活化會(huì)通過破壞腺泡細(xì)胞基底膜而導(dǎo)致干燥綜合征患者唾液腺中的腺泡組織破壞[12]。而IL-1β在唇腺上皮細(xì)胞也異常表達(dá)，揭示了IL-1β 細(xì)胞因子也參與了SS 局部唇腺炎的發(fā)病過程[13]。IL-1β 可通過激活依賴性和非依賴性途徑，誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的新生小鼠細(xì)胞發(fā)生凋亡；在這一過程中，IL-1β 還可通過精密調(diào)控IAPs家族成員的表達(dá)，間接促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡[14]。而IL-6 的產(chǎn)生原因多是受到了TNF-α、IL-1β 的刺激，其主要免疫學(xué)功能是增加中性粒細(xì)胞活性，使中性粒細(xì)胞趨于集中，增強(qiáng)其他細(xì)胞因子的作用效果，在病理狀態(tài)下過高的IL-6 濃度會(huì)導(dǎo)致免疫性病理損傷，是敏感反映機(jī)體炎癥和組織損傷嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)。IL-6 的凋亡抑制作用與兩個(gè)腺體中Bcl-xL 和Mcl-1 的上調(diào)有關(guān)。此外，IL-6 處理誘導(dǎo)了人唾液腺上皮細(xì)胞系中STAT3 的活化以及Bcl-xL 和Mcl-1 基因表達(dá)的上調(diào)[15]。

結(jié)合文獻(xiàn)研究及前期臨床實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，5 μg/mL 活血解毒方凍干粉溶液對(duì)HSG 細(xì)胞凋亡抑制作用最強(qiáng)，對(duì)照組選取的是5 μg/mL 濃度的白芍總苷溶液。IHC 法檢測(cè)各組蛋白Fas、FasL、Cyt-C OD 值，結(jié)果提示中藥組在促進(jìn)抑制Cyt-C 凋亡蛋白表達(dá)方面更優(yōu)于白芍總苷組。Elisa 檢測(cè)檢測(cè)細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6 的濃度，結(jié)果提示模型組能夠促進(jìn)上皮細(xì)胞凋亡相關(guān)炎性因子的升高，也參與了SS 細(xì)胞凋亡的過程。兩治療組均能有效抑制TNF-α、IL-1β、IL-6 炎癥因子的產(chǎn)生，且中藥組在抑制TNF-α、IL-1β 方面更優(yōu)于白芍總苷組。綜上所述，活血解毒方治療SS 真實(shí)有效，且可能是通過有效抑制HSG 細(xì)胞凋亡及炎癥因子的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。