李曉輝，李洪禹，成光宇，李雙娣，劉愛東*

（1.河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，鄭州 450000；2.長春中醫(yī)藥大學附屬第三臨床醫(yī)院，長春 130117；3.長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，長春 130021）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是心血管疾病的主要病因，其特征是大中型血管中形成脂質(zhì)斑塊。有報道指出與年齡相關(guān)的動脈粥樣硬化是所有死亡的40%的假定原因，也是老年人死亡的主要原因[1]。根據(jù)2017 年全球疾病負擔研究顯示，LDL-C 水平升高僅次于高血壓和高鈉飲食，是中國心血管疾病的第三大歸因危險因素[2]。而巨噬細胞過度攝取ox-LDL 或膽固醇流出受阻形成大量的泡沫細胞是動脈粥樣硬化的早期事件。所以調(diào)節(jié)膽固醇的代謝平衡是抗動脈粥樣硬化的首要目標[3]。多項研究發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)中醫(yī)藥通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝在預防和治療動脈粥樣硬化方面發(fā)揮了重要作用，且安全性較高，及在遠期療效方面更有優(yōu)勢[4-7]。散結(jié)通脈方具有清化痰濁，化瘀利水之功，在改善血脂水平、逆轉(zhuǎn)斑塊及改善穩(wěn)定型心絞痛的癥狀及預后方面取得了良好的療效[8-9]。本研究在前期臨床研究的基礎(chǔ)上，用高脂飼喂ApoE-/-小鼠以建立動脈粥樣硬化模型，初步探索散結(jié)通脈方調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝及抗動脈粥樣硬化的作用機制。

1 實驗材料

選取SPF 級7 周齡健康雄性C57BL/6Cnc 小鼠，及以C57BL/6Cnc 小鼠為背景SPF 級7 周齡雄性ApoE-/-小鼠；體質(zhì)量20～24 g。購于北京維通利華實驗動物科技有限公司[許可證號：SCXK（京）2016-0006]。于吉林大學基礎(chǔ)醫(yī)學院SPF 級屏障實驗室進行飼養(yǎng)。普通維持飼料由吉林大學基礎(chǔ)醫(yī)學院動物房提供，高脂飼料由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供（型號D12079B）。散結(jié)通脈方（長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院實驗研究中心提供），阿托伐他汀鈣片（輝瑞制藥有限公司，國藥準字H20051407，規(guī)格10 mg），蘇木素、伊紅（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司），β-Actin 抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，貨號：bs-0061R）；ABCA1 抗體、ABCG1 抗體、SOX9 抗體、CD36 抗體、Goat Anti-Rabbit IgG H&L（HRP）（美國Abcam 公 司，貨 號：ab7360、ab217023、ab185966、ab124515、ab205718），RNA 引物（美國Invitrogen 公司提供）等。全自動生化分析儀（日本日立公司），自動包埋機 EG11OH（德國LEICA 公司），HH-8 數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇科析儀器有限公司），722s 光度計（上海精密科學儀器有限公司），實時熒光定量PCR 儀（美國Stratagene 公司），低溫高速離心機（德國賀利氏公司），光學顯微照相系統(tǒng)（日本奧林巴斯公司），生物顯微鏡（日本尼康公司）等。

2 實驗方法

2.1 造模與分組給藥 選用C57BL/6Cnc 小鼠作為空白組給予普通飼料喂養(yǎng)；ApoE-/-小鼠分為5 組，即模型組給予高脂飼料喂養(yǎng)；散結(jié)通脈方低、中、高劑量組給予高脂飼料喂養(yǎng)，造模成功后中藥低、中、高劑量分別灌胃4 周；阿托伐他汀鈣片組給予高脂飼料喂養(yǎng)，造模成功后阿托伐他汀鈣片灌胃4 周。

其中散結(jié)通脈方按照人和動物間體表面積，計算小鼠等效劑量每天生藥量約為17.0 g/kg，并按照0.5:1:2的比例設置3 個給藥劑量。阿托伐他汀鈣片的小鼠臨床等效劑量約為0.002 6 mg/（g·d）。均釆用灌胃途徑給藥，每天1 次灌胃，連續(xù)干預4 周后取材。

2.2 取材 末次灌胃給藥后，小鼠禁食不禁水12 h，采用摘除眼球法取血，然后頸椎脫位處死。取部分主動脈組織置于多聚甲醛中固定，其他置于凍存管中，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 指標檢測

2.3.1 血脂檢測 采用日立全自動生化分析儀檢測總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白（LDL-C）和高密度脂蛋白含量（HDL-C）。

2.3.2 主動脈病理組織HE 染色 取出多聚甲醛中的標本，經(jīng)酒精逐級脫水、透明處理后包埋成塊，切片約3 μm；用蘇木素染色約3 min；伊紅染色約3 min；再次常規(guī)脫水、透明處理后封片。最后在顯微鏡觀察組織切片并拍照。

2.3.3 免疫組化法檢測ABCA1、ABCG1、SR-A1、CD36蛋白表達 首先將石蠟組織以3 μm的厚度切片，脫蠟水化；避光滴加3%H2O2于切片上封閉；將玻片置于3%BSA 中孵育后，根據(jù)抗體試劑盒說明書，滴加一抗，濕盒中孵育過夜；然后滴加二抗，常溫孵育；DAB 顯色，避光孵育；最后蘇木素復染，透明處理，并滴加中性樹脂進行封片。最后在顯微鏡下觀察并拍照。

2.3.4 Real-time PCR 檢測ABCA1、ABCG1、SR-A1、CD36 mRNA 表達 首先利用Trizol 法提取動脈組織總RNA；根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA；然后配置PCR反應體系。PCR 引物由invitrogen 公司合成，見表1。PCR 擴增的反應條件為cRNA，94 ℃30 s；94 ℃15 s；60 ℃15 s；72 ℃30 s。以上過程各重復40 個循環(huán)。最后應用2-△△Ct方法分析mRNA 的相對表達。

表1 引物序列

2.4 統(tǒng)計學處理 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0 軟件進行分析，分析結(jié)果采用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差（One-way ANOVA）分析。

3 實驗結(jié)果

3.1 散結(jié)通脈方改善ApoE-/-小鼠血脂的作用 與空白組比較，模型組中TC、TG、LDL-C的水平明顯升高（P＜0.01），HDL-C 水平明顯下降（P＜0.01）。與模型組比較，散結(jié)通脈高劑量組和阿托伐他汀組中TC、TG、LDL-C 的水平明顯下降（P＜0.05，P＜0.01），HDL-C 水平明顯升高（P＜0.01）；中藥中劑量組中TC、LDL-C 的水平下降（P＜0.05），HDL-C 水平升高（P＜0.05）。見表2。

表2 各組小鼠血清血脂水平比較（± s） mmol/L

表2 各組小鼠血清血脂水平比較（± s） mmol/L

注：與空白組比較，## P ＜0.01；與模型組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

3.2 各組小鼠主動脈病理組織變化 在空白組中主動脈無斑塊病理改變，血管內(nèi)、中、外膜三層結(jié)構(gòu)完整；未見內(nèi)膜增厚，中膜肌層排列有序。模型組中主動脈可見明顯斑塊病理改變，內(nèi)膜明顯增厚，有巨噬細胞、泡沫細胞及炎性細胞浸潤等，中膜平滑肌細胞排列紊亂，彈力纖維板成波浪狀，板間間隙增大。散結(jié)通脈方不同劑量組呈現(xiàn)不同程度改善，其中低、中劑量組中斑塊減少，仍有內(nèi)膜不光滑，見少量巨噬細胞、泡沫細胞及炎性細胞等。高劑量組和阿托伐他汀組中動脈病變顯著減輕，內(nèi)膜輕度增厚，且不光滑。可見散結(jié)通脈方可以改善ApoE-/-小鼠主動脈斑塊病理變化。

3.3 各組主動脈病理組織中ABCA1、ABCG1、CD36、SR-A1 的表達 與空白組 比較，模型組ABCA1、ABCG1 蛋白表達下降（P＜0.01），CD36、SR-A1 蛋白表達升高（P＜0.01）。與模型組比較，散結(jié)通脈高劑量組和阿托伐他汀組中ABCA1、ABCG1 蛋白顯著上調(diào)（P＜0.05，P＜0.01），中劑量ABCG1 蛋白上調(diào)有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），中劑量ABCA1 及低劑量ABCA1、ABCG1 蛋白有上調(diào)趨勢，但無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；中、高劑量組和阿托伐他汀組中CD36、SR-A1 蛋白顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），低劑量CD36、SR-A1 蛋白有下降趨勢，但無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。見圖2，表3。

表3 各組小鼠主動脈切片CD36 蛋白免疫組化結(jié)果（± s）

表3 各組小鼠主動脈切片CD36 蛋白免疫組化結(jié)果（± s）

注：與空白組比較，## P ＜0.01；與模型組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

圖1 小鼠主動脈HE 染色（100×）

圖2 各組小鼠主動脈病理組織中ABCA1、ABCG1、CD36、SR-A1 蛋白免疫組化結(jié)果（200×）

3.4 RT-PCR 法觀察主動脈病理組織中ABCA1、ABCG1、CD36、SR-A1mRNA表達水平的影響 見表4。

表4 各組主動脈病理組織中mRNA 表達水平比較（± s）

表4 各組主動脈病理組織中mRNA 表達水平比較（± s）

注：與空白組比較，## P ＜0.01；與模型組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

4 討論

動脈粥樣硬化是動脈管壁的一種慢性疾病，而脂質(zhì)沉積和炎癥在斑塊的發(fā)病機制中起著核心作用。早在19 世紀，Nicolai Anitschkow 提出“無膽固醇無動脈粥樣硬化”。動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展主要是由LDL-C進入損傷的血管內(nèi)膜開始，形成氧化低密度脂蛋白（ox-LDL），被進入內(nèi)膜的巨噬細胞不斷攝取形成泡沫細胞，泡沫細胞最終壞死崩解后導致脂質(zhì)和復合糖類等的積聚，逐漸演變成脂滴、脂質(zhì)紋及脂質(zhì)核等，觸發(fā)及加重動脈硬化病變。多項研究還發(fā)現(xiàn)，膽固醇積聚可以激活炎癥、誘導氧化應激、增加內(nèi)皮損傷等促進動脈粥樣硬化[11-13]。因此，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝是防治動脈粥樣硬化病程進展中重要的環(huán)節(jié)。

在本研究中，模型組小鼠血清血脂明顯失調(diào)，主動脈病理組織HE 染色顯示脂質(zhì)斑塊聚集明顯。在給予不同劑量散結(jié)通脈方和阿托伐他汀組后，小鼠血清中TC、TG、LDL 水平呈濃度依賴型降低，且高劑量組下降最顯著，優(yōu)于阿托伐他汀組；HDL 呈濃度依賴型升高，高劑量組顯著升高。主動脈病理組織HE 染色結(jié)果顯示，不同劑量散結(jié)通脈組和阿托伐他汀組能明顯改善斑塊大小，以高劑量組最佳。由此可見，散結(jié)通脈方可有效調(diào)節(jié)血脂水平及改善動脈粥樣硬化病變。

在動脈粥樣硬化病程中，脂質(zhì)的代謝包括膽固醇的攝取和流出等，主要受膽固醇逆轉(zhuǎn)運（reverse cholesterol transport，RCT）途徑和清道夫受體（scavenger receptors，SRs）的調(diào)節(jié)。RCT 作為積聚的膽固醇從血管壁運輸?shù)礁闻K排泄的主要途徑，是抗動脈硬化的重要機制之一[14]。膽固醇流出是RCT 途徑最關(guān)鍵的一步，主要通過ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體A1（ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1）和ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體G1（ATP-binding cassette transporter G1，ABCG1）等將積累的膽固醇從血管壁內(nèi)膜下的細胞中轉(zhuǎn)移至高密度脂蛋白（high density lipoproteins，HDL）或載脂蛋 白a-I（apolipoprotein A-I，apoA-I）[14]。ABCA1 和ABCG1 是ABC 轉(zhuǎn)運蛋白超家族的成員。其中ABCA1是一種全尺寸的ABC 轉(zhuǎn)運體，參與RCT 初始階段，通過介導細胞內(nèi)膽固醇和磷脂酰膽堿外流到細胞表面的apoA-I，產(chǎn)生新生高密度脂蛋白（preβ-HDL），對血液中HDL 的生物合成至關(guān)重要[15]。研究發(fā)現(xiàn)，ABCA1通過與apoA-I結(jié)合，增加抗炎細胞因子的產(chǎn)生，減少促炎介質(zhì)的釋放，改善動脈硬化病變[16]。ABCG1是一種半型ABC 轉(zhuǎn)運體，只有一個核苷酸結(jié)合域和一個跨膜域，并形成一個同源二聚體發(fā)揮功能。ABCG1主要介導膽固醇和磷脂酰膽堿等外流到血液或淋巴中HDL 顆粒，同時將膽固醇從外周細胞轉(zhuǎn)移到肝臟進行膽汁排泄，從而防治動脈粥樣硬化性血管疾病。研究發(fā)現(xiàn)，敲除巨噬細胞ABCG1 后，不僅促進細胞內(nèi)氧化固醇的堆積，還加速了細胞的凋亡，促進動脈硬化[17]。綜上可知，提高血漿或組織中ABCA1 和ABCG1 表達水平，繼而發(fā)揮抗動脈硬化作用十分重要。在本研究中，模型組小鼠動脈病理組織中ABCA1 和ABCG1 蛋白表達量顯著降低。在給予散結(jié)通脈方后，可有效提高動脈硬化小鼠主動脈組織中ABCA1、ABCG1 蛋白水平，以高劑量組藥效最佳。

研究發(fā)現(xiàn)，清道夫受體分化簇36（cluster of differentiation 36，CD36）和A1 類清道夫受體（class A1 scavenger receptor，SR-A1）作為動脈粥樣硬化病程中膽固醇攝取的主要貢獻者[18]，通過巨噬細胞不受限制的吸收氧化低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL），導致脂質(zhì)不斷積累并形成泡沫細胞，從而促進動脈粥樣硬化。而在缺乏或抑制任何一種受體的小鼠中顯示出動脈粥樣硬化病變的減少[19-20]。有研究指出，CD36 介導的天然LDL 內(nèi)吞促進泡沫細胞的形成，是早期動脈斑塊形成的關(guān)鍵機制[14]。除此以外，CD36 可以通過與多種配體結(jié)合，參與巨噬細胞炎癥反應、血小板激活和聚集等途徑促進動脈斑塊[21]。在ApoE 小鼠中，SR-A1 表達降低可以減少ox-LDL 的攝取，抑制泡沫細胞的生成和動脈斑塊的發(fā)展[22]。此外，SR-A1 還可以介導先天免疫[23]、血管內(nèi)皮功能[24]等。因此，SR-A1 可能受到多種調(diào)節(jié)劑的影響動脈斑塊相關(guān)疾病。在本研究中，模型組小鼠動脈病理組織中CD36 和SR-A1 蛋白表達量顯著升高，給予各劑量散結(jié)通脈方后，可有效降低CD36、SR-A1 蛋白水平，促進脂質(zhì)的代謝，改善動脈硬化斑塊的病理變化。以高劑量組藥效最佳。

綜上所述，散結(jié)通脈方可通過促進ABCA1、ABCG1表達及降低CD36、SR-A1表達，改善血脂水平，抑制動脈斑塊病程進展。因此，散結(jié)通脈方調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，即促進膽固醇外流及抑制膽固醇蓄積，可能是散結(jié)通脈方抗動脈粥樣硬化的作用機制之一。