郭 剛 王麗芳 王康英

莆田學院附屬醫(yī)院，福建省莆田市 351100

我國是出生缺陷高發(fā)國家，數(shù)據(jù)顯示染色體異常作為重要的遺傳缺陷，可能會影響1/200～1/150的新生兒[1]。目前尚無治療染色體疾病的有效方法，因此作為二級預(yù)防的產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷顯得尤為關(guān)鍵。胎兒染色體非整倍體異常在出生缺陷兒中的發(fā)病率較高，準確篩查及診斷是臨床迫其需求的，目前臨床應(yīng)用最為廣泛的是血清學篩查，但篩查準確性不可靠，漏診率高[2]，而介入性產(chǎn)前診斷，容易引起孕婦焦慮和恐懼，并有導(dǎo)致流產(chǎn)和宮內(nèi)感染的風險[3]。無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(NIPT)技術(shù)僅需采取孕婦靜脈血，利用高通量測序技術(shù)對母體外周血漿中的游離胎兒DNA片段進行測序，進行生物信息分析，從中得到胎兒染色體非整倍體信息[4-5]。NIPT已經(jīng)成為一種新的篩查技術(shù)。本研究對2 464例血清學篩查臨界風險自愿進行NIPT的孕婦進行研究，結(jié)合介入性產(chǎn)前診斷的結(jié)果，分析NIPT對唐氏篩查臨界風險者的應(yīng)用價值。

1 資料和方法

1.1 背景資料 選取2017—2019年間在我院血清學篩查臨界風險且進入無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測的2 464例孕婦為研究對象。納入標準：(1)自愿NIPT；(2)1年內(nèi)沒有異體輸血、細胞治療等；(3)夫妻雙方無明確染色體異常；(4)超聲單胎；(5)預(yù)產(chǎn)年齡<35周歲；(6)體重指數(shù)<40等。對選擇NIPT的孕婦應(yīng)充分告訴該方法的適應(yīng)證、局限性等，并簽署知情同意書，對結(jié)果高風險者建議做介入性產(chǎn)前診斷，對納入對象隨訪其妊娠結(jié)局及產(chǎn)后胎兒情況。

1.2 方法

1.2.1 中孕唐氏篩查：空腹狀態(tài)下抽取孕婦靜脈血2～3ml于空白管，離心盡快分離血清并及時檢測，未及時檢測的標本需低溫保存。中孕期唐氏篩查采用血清學三聯(lián)篩查即AFP+ Free-βhCG+uE3。儀器為芬蘭PerkinElmer公司提供的DELFLA 1 235型號，試劑為其配套試劑盒。根據(jù)檢測值再結(jié)合孕婦孕產(chǎn)年齡、孕周、體重等利用分析軟件給出該孕婦懷染色體非整倍體胎兒的風險率。唐氏篩查臨界風險截斷標準：21-三體為1/1 000～1/271；18-三體為1/1 000～1/351。

1.2.2 無創(chuàng)基因產(chǎn)前檢測(NIPT)：抽取孕婦外周血10ml于康健游離核酸保存采血管(CFDNA)后，立刻顛倒混勻，常溫8～30℃保存，并于當日送往福州博奧生物集團有限公司。測序儀器為基因測序儀BES4000，分析軟件為無創(chuàng)產(chǎn)前數(shù)據(jù)分析管理系統(tǒng)V3.0。通過高通量基因測序檢測孕婦外周血胎兒游離DNA并進行生物信息分析。NIPT正常范圍為-3.0

1.2.3 染色體核型分析：對NIPT異常結(jié)果經(jīng)臨床醫(yī)生咨詢后自愿選擇介入性產(chǎn)前診斷的孕婦，在超聲的引導(dǎo)下經(jīng)腹行羊膜腔穿刺，抽取25ml，送實驗室培養(yǎng)、收獲、固定、G顯帶等，計數(shù)2個獨立培養(yǎng)瓶的40個細胞，分析20個細胞，分辨率達320～400條帶水平。以人類細胞遺傳學命名的國際體制(ISCN)2016作為核型分析的標準。

1.3 后續(xù)追蹤和隨訪 對NIPT低風險的孕婦后續(xù)追蹤其彩超情況并隨訪其妊娠結(jié)局及新生兒情況，NIPT高風險孕婦建議進入產(chǎn)前診斷，關(guān)注其診斷結(jié)果并隨訪妊娠結(jié)局，對拒絕介入性產(chǎn)前診斷的應(yīng)隨訪其妊娠結(jié)局及產(chǎn)后新生兒表現(xiàn)。

2 結(jié)果

本文通過研究2 464例唐氏篩查臨界風險自愿行NIPT的孕中期孕婦，結(jié)果為NIPT提示高風險24例，篩查陽性率為0.97%(24/2 464)。其中6例21-三體(T21)高風險，5例18-三體(T18)高風險，1例T18和T13共同高風險，7例性染色體異常，其他異常5例。對結(jié)果異常者的孕婦，電話通知至本院遺傳咨詢門診，經(jīng)咨詢并同意選擇介入性產(chǎn)前診斷的孕婦19例，核型分析結(jié)果11例異常(其中確診4例21-三體，5例性染色體，其他核型異常2例)，核型正常8例。經(jīng)分析NIPT的陽性預(yù)測值為57.89%(11/19)，具體見表1。

表1 24例NIPT高風險及核型分析結(jié)果

NIPT高風險拒絕介入性產(chǎn)前診斷的5例孕婦進行隨訪，其中3例18-三體高風險者因彩超提示多發(fā)畸形而選擇直接引產(chǎn)，其他2例隨訪孕婦自述胎兒無明顯形態(tài)異常。2 440例NIPT低風險隨訪至分娩后，其中59例隨訪不到，隨訪率97.58%，隨訪中發(fā)現(xiàn)3例流產(chǎn)，4例胎死宮內(nèi)，7例不同程度彩超異常而引產(chǎn)，其余均未發(fā)現(xiàn)有明顯染色體異常新生兒。

3 討論

1997年，香港中文大學羅玉明教授首次證明孕婦外周血中有胎兒游離DNA，來源于胎盤，開辟了無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(NIPT)的新方法。迄今為止，它已在世界許多國家得到廣泛應(yīng)用[6]。無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測采用新一代高通量測序技術(shù)，基于母體血漿檢測游離胎兒DNA。經(jīng)過生物信息學分析，檢測出胎兒染色體異常，國內(nèi)外研究表明NIPT具有無創(chuàng)、安全、快速、準確性和可靠性高等特點[7-8]。NIPT篩查具有一定的臨床實用價值[9]。

目前臨床常用的產(chǎn)前診斷模式是血清學篩查高風險建議進入介入性產(chǎn)前診斷，這種模式還是會導(dǎo)致30%～40%的缺陷兒漏診[10]，為此有學者提出臨界風險的定義，研究報道有一定比例的漏篩出現(xiàn)在血清學篩查臨界風險的孕婦中[11]，因此對這部分人群的篩查很有必要的。且羊膜穿刺術(shù)有嚴格的適應(yīng)證和禁忌證[12-13]這種方法可能會帶來胎兒宮內(nèi)感染和羊水漏出的風險，同時增加孕婦的心理壓力，因此在孕婦中接受率不高。在一定程度上限制了臨床應(yīng)用。因此，尋求一種合理實用的產(chǎn)前篩查診斷方法，實現(xiàn)胎兒染色體疾病的準確檢測，對于降低出生缺陷的發(fā)生率具有重要意義。

本文選取2017年1月—2019年12月在本院血清學篩查結(jié)果臨界風險經(jīng)咨詢自愿選擇NIPT的單胎非高齡孕婦為研究對象，篩查出24例NIPT高風險孕婦，21-三體6例，18-三體5例，性染色體異常7例，T18和T13共同高風險1例，其他異常5例。咨詢建議行介入性產(chǎn)前診斷的19例，經(jīng)核型及芯片結(jié)果確診符合的有11例，21-三體4例，18-三體0例，性染色體異常5例，其他異常2例。本文研究了2 464例孕婦，其中NIPT低風險的孕婦中59例沒有隨訪到。所以統(tǒng)計人數(shù)按2 405計。敏感性=真陽性病例數(shù)/(真陽性病例數(shù)+假陰性病例數(shù))，特異性=真陰性病例數(shù)/(真陰性病例數(shù)+假陽性病例數(shù))，陽性預(yù)測值=真陽性病例數(shù)/(真陽性病例數(shù)+假陽性病例數(shù))，本研究中未出現(xiàn)假陰性病例。所以該方法對21-三體的敏感性為100%，特異性均為99.9%(2 403/2 405)，陽性預(yù)測值為66.67%(4/6)，性染色體的陽性預(yù)測值為71.43%(5/7)，而18-三體陽性預(yù)測值為0，可能因為數(shù)據(jù)不足和18-三體綜合征的胎兒往往表現(xiàn)多種臟器畸形，孕婦直接選擇引產(chǎn)。血清學臨界風險者相對高風險者基數(shù)較大，對其均行介入性產(chǎn)前診斷是不可取的，隨著技術(shù)的發(fā)展，2015年專家提出了NIPT可以應(yīng)用于中風險人群的共識[14]。有研究表明，臨界風險的孕婦中生育唐氏兒的風險為0.46%[13]，本文確診4例21-三體，故唐氏兒的風險率為0.17%(4/2 405)的唐氏缺陷兒。目前國內(nèi)外對NIPT應(yīng)用于血清學篩查臨界風險的單胎非高齡的報道較少，本研究表明對于唐氏篩查臨界風險的單胎非高齡孕婦進行NIPT篩查是具有意義的，篩查陽性率為0.97%(24/2 464)。特殊病例討論：本研究出現(xiàn)1例NIPT提示T21/Chr4+/Chr8+異常的孕婦最終核型發(fā)現(xiàn)是正常的，后續(xù)隨訪發(fā)現(xiàn)孕婦本身患有白血病，因為惡性腫瘤干擾胎兒游離DNA的檢測，影響檢測結(jié)果[15]。

綜上所述，妊娠女性外周血胎兒游離DNA的高通量測序技術(shù)可用于臨界風險妊娠女性胎兒染色體疾病的產(chǎn)前篩查，具有較高的敏感性和特異性?？梢宰鳛楫a(chǎn)前診斷的重要補充，可以降低血清學臨界風險孕婦的穿刺率，降低出生缺陷的發(fā)生。但 NIPT 存在一定程度的假陽性，并且NIPT作為一種篩查技術(shù)，篩查異常者仍需結(jié)合傳統(tǒng)的羊水細胞核型分析，以提高對胎兒染色體疾病的診斷效能。