李建春

南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院，江西省南昌市 330006

梅毒是梅毒螺旋體(TP)感染引發(fā)的一種慢性傳染性疾病，其臨床表現(xiàn)因人而異，早期主要以侵犯皮膚、生殖器為主，隨著病情的進(jìn)展會(huì)逐漸擴(kuò)散至淋巴、血液循環(huán)甚至全身組織，導(dǎo)致多器官損傷[1-2]。早期診斷是提升治療效果及預(yù)后的基礎(chǔ)，梅毒螺旋體明膠凝集試驗(yàn)(TPPA)以高敏感度、高特異性的優(yōu)勢(shì)被普遍作為人感染梅毒診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但該種檢測(cè)方式操作難度大、對(duì)醫(yī)師專業(yè)素質(zhì)要求極高且費(fèi)用昂貴，無法在早期篩查中推廣[3-4]。此外，在檢測(cè)指標(biāo)選擇方面，外周血液中IgG抗體在診斷原發(fā)人梅毒感染中需要?jiǎng)用}監(jiān)測(cè)，而以IgM陽性為原發(fā)感染的指標(biāo)會(huì)出現(xiàn)假陽性的情況。近年來，人們發(fā)現(xiàn)特異性IgG抗體(Tp-IgG)親和指數(shù)(AI)在診斷原發(fā)性感染性疾病中效果較好，該檢測(cè)方法操作簡單，只需在常規(guī)IgG的酶免疫反應(yīng)中進(jìn)行尿素變性、洗脫便可實(shí)現(xiàn)[5]。目前，特異性IgG抗體親和力法在巨細(xì)胞病毒感染、艾滋病毒感染診斷中均得到應(yīng)用且效果顯著[6-7]。本研究則分析酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)梅毒螺旋體Tp-IgG AI在原發(fā)人梅毒感染診斷中的可行性。

1 資料與方法

1.1 樣本來源 選取2019年4月—2021年4月間我院收治的梅毒螺旋體感染患者87例，其中男49例、女38例，年齡21～55歲，平均年齡(31.5±7.8)歲，病程4個(gè)月～3年，平均病程(1.3±0.4)年。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)參考《中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)指南共識(shí)：新版梅毒診斷標(biāo)準(zhǔn)(WS 273-2018)》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)；臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、淋巴結(jié)腫大、硬下疳及皮疹等癥狀；(2)臨床資料完整，檢查依從性良好；(3)患者對(duì)試驗(yàn)知情且自愿簽署同意書；(4)經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)伴其他傳染性疾病者；(2)合并肝腎等重要臟器器質(zhì)性損傷、免疫系統(tǒng)疾病者；(3)意識(shí)障礙、無法正常交流者。

1.2 方法

1.2.1 ELISA檢測(cè)TP-IgG及TP-IgM：實(shí)驗(yàn)前30min將試驗(yàn)試劑置于20～25℃的環(huán)境中，嚴(yán)格按照試劑盒的操作說明進(jìn)行實(shí)驗(yàn)步驟：(1)按照1∶101的比例稀釋血液樣本；(2)將被純化的TP抗原的聚苯乙烯孔，在各孔中加100μl陰性、陽性對(duì)照和稀釋樣品，預(yù)留1孔不加試劑；(3)將反應(yīng)板蓋上后放置于(37±1)℃環(huán)境孵育60min；(4)孵化后加經(jīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗人-IgG、IgM結(jié)合物(購自丹麥DAKO生物科技公司)，再行孵育和清洗，加原色和酶底物避光處理，再加H2SO4抑制液，最后用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔OD值。

結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)[8]：TP-IgG酶標(biāo)儀檢測(cè)的OD值≤0.25為陰性；0.25

1.2.2 ELISA法檢測(cè)TP-IgG AI：(1)血清標(biāo)本以1∶101稀釋，加入被純化TP抗原的聚苯乙烯孔(每例均做平行2孔)，37℃孵育；(2)一孔用PBST緩沖液洗滌5次，另外一孔用PBST洗滌1次，使用蛋白變性劑(尿素8.0mol/L+硫氰酸銨3.0mol/L+鹽酸胍4.0mol/L+二乙胺35.0mmol/L),10min后PBST洗滌1次；(3)所有孔加100μl辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗人-IgG結(jié)合物(1∶6 000)，37℃孵育1h，去除孔內(nèi)液體，用PBST洗滌5次，在每孔中加顯色劑，經(jīng)H2SO4終止反應(yīng)后測(cè)定孔內(nèi)OD值。AI=溫和蛋白變性劑洗脫孔內(nèi)標(biāo)本OD值/(PBST)洗脫孔內(nèi)標(biāo)本OD值。

1.3 觀察指標(biāo) (1)感染類型分組標(biāo)準(zhǔn)[9]：基于TP-IgG、TP-IgM抗體檢測(cè)對(duì)梅毒螺旋體感染患者進(jìn)行分組：既往感染組(A組)，TP-IgG檢測(cè)為陽性而TP-IgM檢測(cè)為陰性；繼發(fā)/再感染組(B組)，TP-IgG檢測(cè)為陽性而TP-IgM檢測(cè)為弱陽性；原發(fā)感染組(C組)，TP-IgG檢測(cè)為陰性而TP-IgM檢測(cè)均為陽性/強(qiáng)陽性。(2)TP-IgG AI診斷原發(fā)人梅毒感染的靈敏度、特異度：以是否為原發(fā)感染者分為兩組，分析不同診斷標(biāo)準(zhǔn)時(shí)TP-IgG AI診斷原發(fā)人梅毒感染的效能。實(shí)驗(yàn)中分別以TP-IgG AI<20%、<25%、<30%、<35%、<40%、<45%、<50%等標(biāo)準(zhǔn)時(shí)診斷的敏感度和特異度。(3)對(duì)比原發(fā)人梅毒感染及非原發(fā)人梅毒感染患者TP-IgG AI值及分布情況。

2 結(jié)果

2.1 87例患者感染類型情況 87例梅毒螺旋體感染患者經(jīng)TP-IgG及TP-IgM檢測(cè)結(jié)果顯示，既往感染組52例(59.77%)，繼發(fā)/再發(fā)感染組患者14例(16.09%)，原發(fā)感染組21例(24.14%)，見表1。

表1 87例梅毒螺旋體感染患者的類型分析

2.2 TP-IgG AI在原發(fā)人梅毒螺旋體感染與非原發(fā)感染的效能 基于TP-IgG與TP-IgM檢測(cè)的結(jié)果，以是否為原發(fā)人梅毒螺旋體感染者分為兩組：原發(fā)感染組21例，非原發(fā)感染組66例。分析顯示當(dāng)TP-IgG AI值>35%且<40%時(shí)Youden指數(shù)最高(0.732)，見表2。

表2 檢測(cè)TP-IgG AI不同標(biāo)準(zhǔn)時(shí)的敏感度、特異度

2.3 原發(fā)與非原發(fā)人梅毒螺旋體感染組患者TP-IgG AI值及分布情況 非原發(fā)感染組患者 AI值顯著高于原發(fā)感染組(t=8.105,P<0.05);非原發(fā)感染組患者AI值多分布在45%～50%，而原發(fā)感染組多集中在<35%，非參數(shù)檢驗(yàn)u=7.635，P<0.05。見表3。

表3 原發(fā)感染組與非原發(fā)感染組TP-IgG AI值及分布情況

3 討論

梅毒螺旋體感染早期呈潛伏狀態(tài)，可無臨床癥狀，隨著病情進(jìn)展會(huì)出現(xiàn)多系統(tǒng)器官損傷，甚至引發(fā)各種并發(fā)癥，嚴(yán)重危害患者的身心健康[10-11]。該癥按照病情進(jìn)展情況一般分為Ⅰ～Ⅲ期，且隨著分期的進(jìn)展不僅對(duì)自身機(jī)能損傷更為嚴(yán)重，還會(huì)提升傳染性。梅毒螺旋體無法在體外生長，因此梅毒感染的診斷及療效評(píng)估需要依靠既往病史、臨床癥狀和實(shí)驗(yàn)室檢查做綜合評(píng)估，尤其依賴實(shí)驗(yàn)室血清學(xué)指標(biāo)[12]。梅毒血清學(xué)實(shí)驗(yàn)中依據(jù)抗原類型分為非特異性抗原、特異性螺旋體抗原兩種類型。TRUST主要用于檢測(cè)梅毒血清非特異性抗體，但非特異性抗體的效價(jià)會(huì)隨著病情進(jìn)展與梅毒病毒活動(dòng)性呈平衡態(tài)，因此多被應(yīng)用于療效評(píng)估、復(fù)發(fā)或再感染的血液學(xué)指標(biāo)[13]。梅毒特異性抗體及非特異性抗體同時(shí)檢測(cè)能夠一定程度排除生物學(xué)假陽性顯像[14]。目前，歐美等發(fā)達(dá)國家梅毒管理指南[15]中多推薦將特異性抗體作為梅毒早期篩查指標(biāo)，從檢測(cè)效率來看特異性抗體的檢出時(shí)間較非特異性節(jié)約兩周時(shí)間，再結(jié)合患者的臨床癥狀表現(xiàn)則能夠幫助醫(yī)師發(fā)現(xiàn)感染，并且迅速響應(yīng)制定針對(duì)性的治療措施。

TP感染后會(huì)刺激人體產(chǎn)生特異性IgG、IgM及IgE等抗體，因此通過檢測(cè)TP-Ig抗體便可間接判斷[16]；與此同時(shí)，鑒別既往感染、繼發(fā)感染及原發(fā)感染對(duì)臨床治療意義重大。TP-IgG是梅毒螺旋體感染后患者最先產(chǎn)生的抗體且能長期存在其體內(nèi)，已有大量實(shí)驗(yàn)室建立了TP特異性IgG抗體ELISA檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，但多以自己設(shè)定的標(biāo)準(zhǔn)為參考值，缺乏統(tǒng)一的診斷標(biāo)準(zhǔn)；再加上TP-IgG在診斷時(shí)需要?jiǎng)討B(tài)監(jiān)測(cè)導(dǎo)致漏診率高，因此無法在梅毒感染篩查中推廣。TP-IgM也是在病毒感染早期產(chǎn)生的抗體，但其在血液中持續(xù)時(shí)間一般低于16周[17]，基于TP-IgM出現(xiàn)早、存留時(shí)間短的特點(diǎn)能夠作為原發(fā)人梅毒感染的診斷指標(biāo)。但僅通過檢測(cè)TP-IgM抗體鑒別原發(fā)性人梅毒感染存在以下幾個(gè)問題：(1)少部分感染患者血液中特異性IgM長期存在[18]。(2)特異性IgM抗體檢測(cè)期間很容易被其他病毒感染產(chǎn)生干擾或交叉反應(yīng)，從而出現(xiàn)假陽性[19-20]。(3)部分潛伏感染、復(fù)發(fā)感染者血液中也存在少量的被激活的特異性IgM抗體。TP病毒感染早期機(jī)體產(chǎn)生的特異性IgG抗體親和力較低，經(jīng)幾周發(fā)育親和力不斷增加，因此TP-IgG AI鑒別診斷原發(fā)TP感染成為研究的熱點(diǎn)。

本研究依據(jù)TP-IgG、TP-IgM聯(lián)合檢測(cè)對(duì)87例患者的類型進(jìn)行區(qū)分，結(jié)果顯示既往感染占比59.77%，繼發(fā)/再發(fā)感染占比為16.09%，而原發(fā)感染占比為24.14%。觀察發(fā)現(xiàn)當(dāng)AI值<40%時(shí)原發(fā)TP與非原發(fā)TP的鑒別診斷Youden指數(shù)最高為0.732；此外，發(fā)現(xiàn)原發(fā)TP組患者AI值明顯低于非原發(fā)感染組(P<0.05)。觀察AI值分布情況發(fā)現(xiàn)，原發(fā)TP組AI值多集中在<35%的范圍，而非原發(fā)TP組AI值集中在45%～50%區(qū)間，由此說明TP-IgG AI能夠一定程度鑒別診斷原發(fā)TP感染。

綜上所述，TP-IgG AI診斷原發(fā)人梅毒感染具有一定價(jià)值，本研究的不足有兩個(gè)方面：首先，納入樣本量較小，可能造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏倚；其次，未依據(jù)病情程度(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級(jí))來觀察TP-IgG AI的差異，希望在以后盡量開展大樣本、多中心臨床研究，以獲得更精確的數(shù)據(jù)為人梅毒感染的診斷治療提供參考。