張金彪 孫海榮 李夢凡 沈騰群 王 彤 趙俊武 李 芳 李振光

1 威海市立醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東省威海市 264200； 2 錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是最常見的癡呆形式，其特征是大腦的退行性變，但越來越多的證據(jù)表明血管疾病也可能起作用[1]。腦微出血(Cerebral microbleeds, CMBs)反映了腦小血管滲漏引起的局灶性含鐵血黃素沉積，在AD患者中比一般老年人群更常見[2]。CMBs的發(fā)病機制包括血管危險因素引起的內(nèi)皮功能障礙、血腦屏障(Blood-brain barrier, BBB)損傷以及β-淀粉樣蛋白沉積[3]。因此，CMBs可能有助于解釋AD的神經(jīng)退行性病理機制和腦血管機制的重疊。

血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)是一種血管生成糖蛋白，在血管生成的生理和病理過程中發(fā)揮重要作用。我們既往研究發(fā)現(xiàn)，血清VEGF水平與AD患者中CMBs的出現(xiàn)相關(guān)[4]。眾所周知，VEGF基因缺乏會影響VEGF蛋白水平，并破壞血管的發(fā)育和維持[5]。VEGF與其受體酪氨酸激酶、VEGF受體-1和VEGF受體-2(VEGFR2)結(jié)合，其中VEGFR2是介導(dǎo)血管生成的關(guān)鍵受體[6]，對內(nèi)皮細胞的生存和完整性的維持起著重要作用[7]。我們的研究評估了VEGF和VEGFR2基因變異對VEGF蛋白循環(huán)水平的影響，以及對AD患者CMBs的影響。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2016年12月—2020年12月在威海市立醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科就診的406例散發(fā)性AD(Sporadic AD, SAD)患者設(shè)為病例組，其中AD患者又分為伴CMBs的AD患者121例和不伴CMBs的AD患者285例。根據(jù)美國國家神經(jīng)病、語言交流障礙和卒中研究所以及阿爾茨海默病及相關(guān)疾病協(xié)會(NINCDS-ADRDA)的標準對可能的AD進行診斷。CMBs定義磁敏感加權(quán)成像(SWI)序列上的圓形、低強度均勻病灶，病灶大小達10mm[8]。從威海市立醫(yī)院門診部招募年齡和性別匹配的332例非AD患者為對照組，進行標準健康檢查，并通過長谷川癡呆量表(HDS)和簡易精神狀態(tài)檢查(MMSE)確認健康和認知正常。對所有受試者進行了醫(yī)學訪談、體格檢查、神經(jīng)心理評估、血液標本留取和腦核磁共振成像?；颊吲懦龢藴剩?1)有神經(jīng)退行性疾病或其他癡呆癥的家族史；(2)癌癥；(3)先前有卒中或頭部外傷史；(4)嚴重的心臟、腎臟或肝臟疾??；(5)近期感染或炎癥病史。研究對象均為中國北方漢族人群。本研究獲得威海市醫(yī)院倫理委員會批準。書面同意由受試者或受試者的監(jiān)護人簽署。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集：記錄完整的臨床和家族史以及常規(guī)血管危險因素：飲酒、吸煙、收縮壓和舒張壓以及體重指數(shù)。高血壓定義為不同時間的3次血壓≥140/90mmHg(1mmHg=0.133kPa)或應(yīng)用降壓藥。糖尿病的診斷是基于降糖治療或反復(fù)抽血化驗提示空腹血糖水平≥7 mmol/L(126mg/dl)或口服葡萄糖2h后餐后血糖值≥11.1mmol/L(200mg/dl)?？偰懝檀肌?00mg/dl或低密度脂蛋白膽固醇≥130mg/dl為高脂血癥。記錄吸煙史、飲酒史。

1.2.2 生化指標測定：患者在夜間禁食后，于早上6～8點采集血液樣本。樣品離心(400g,10min)，分離血清和細胞層，然后保存在-70℃等待分析。生化指標(甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇和空腹血糖)使用自動分析儀(日立7600，東京，日本)測定。采用標準的酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定血清VEGF和VEGFR2水平。VEGF和VEGFR2免疫檢測試劑盒使用R&D系統(tǒng)(Minneapolis,MN,USA)。

1.3 磁共振成像(MRI)評估 MRI檢查采用Magnetom Trio全身3.0-T MR掃描儀(Siemens, Erlangen, Germany)，梯度為40mt/m。采用集成并行采集技術(shù)，所有采集均采用僅接收8通道相控陣頭部線圈。收集T1和T2加權(quán)成像、彌散加權(quán)成像(DWI)、流體衰減反轉(zhuǎn)恢復(fù)序列成像(FLAIR)和磁敏感加權(quán)成像(SWI)。經(jīng)DWI確診為急性缺血性梗死。CMBs定義：SWI序列上的圓形、低強度均勻病灶，病灶大小達10mm[8]。如果出現(xiàn)血管流空現(xiàn)象(基于溝的位置或線形)、基底神經(jīng)節(jié)鈣化或來自鄰近骨或竇的偽影，則排除低信號病變。2名經(jīng)驗豐富的神經(jīng)影像科醫(yī)生分別確定SWI成像中CMBs的數(shù)量，并一致確定。

1.4 基因變異選擇和基因分型 根據(jù)HapMap基因型數(shù)據(jù)和潛在的生物學功能，選擇啟動子區(qū)中4個影響VEGF表達的標記變異，包括rs157036(-116G>A)、rs833061 (-460T>C)、rs2010963 (405G>C)、rs3025039(+936C>T)。我們選擇了VEGFR2的外顯子變異體rs2305948，該變異體可導(dǎo)致Val297Ile(對配體受體結(jié)合很重要)的非同義氨基酸轉(zhuǎn)化。選擇啟動子區(qū)域rs2071559(-604T>C)和rs1870377(-1719T>A)(可能影響VEGFR2表達)。所有單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism,SNP)序列均來自HapMap數(shù)據(jù)庫(www.hapmap.org)。使用DNA分離試劑盒(Thermo Fisher Scientific,USA)按照制造商的流程從外周血樣本中分離基因組DNA。在Sequenom MassARRAY平臺(Sequenom,San Diego,CA,USA)上使用384孔板進行VEGF和VEGFR2多態(tài)性的基因分型。使用Sequenom Assay Design 3.1軟件(Sequenom)設(shè)計用于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增和單堿基延伸試驗的引物。引物購自生工生物技術(shù)(上海)有限公司?；蚍中陀蓪嶒炇胰藛T進行，實驗人員對受試者狀況一無所知。為進行質(zhì)量控制，隨機抽取10%的受試者進行重復(fù)樣本基因分型，結(jié)果符合率為100%。兩位作者獨立審查了所有基因分型結(jié)果。

所有研究對象均使用之前描述的標準Sanger測序方法進行APOE基因分型[9]。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征 對照組和AD患者的人口學統(tǒng)計學資料和臨床特征見表1，AD患者根據(jù)是否合并CMBs進行分組。與對照組相比，AD組患者受教育時間更短，糖尿病患病率更高，更有可能攜帶至少一個APOEε4等位基因。伴CMBs的AD患者與不伴CMBs的AD患者相比，年齡、高血壓患病率以及攜帶至少一個APOEε4等位基因存在顯著差異。然而，AD伴CMBs組與AD不伴CMBs組在性別、受教育時間、糖尿病、高血脂、吸煙、飲酒或BMI方面均無顯著差異。

2.2 對照組和AD組VEGF和VEGFR2 SNPs基因型和等位基因頻率的關(guān)系 VEGF和VEGFR2 SNPs在對照組和AD組中的基因型和等位基因頻率見表2。在所有受試者中，VEGF和VEGFR2基因中所有變異的頻率分布均未明顯偏離Hardy-Weinberg平衡。校正年齡、性別、高血壓、糖尿病、高脂血癥、吸煙、飲酒、BMI或攜帶至少一個APOEε4等位基因后，所有檢測的VEGF變異均與AD無關(guān)。在VEGFR2基因中，變異型-1719T>A與AD易感性增加相關(guān)(TA:OR 1.798，95%CI 1.287～2.514，P= 0.001;AA:OR 2.207，95% CI 1.332～3.657，P=0.002;TT/TA+AA顯性:OR 1.798，95%CI 1.307～2.475，P<0.001)。在校正年齡、性別、腦血管危險因素和至少攜帶一個APOEε4等位基因后，rs2305948多態(tài)性的llelle和Vallle+llelle(攜帶lle-等位基因)基因型頻率與AD相關(guān)(llelle:OR 5.720，95%CI 1.885～17.360，P=0.002;ValIle+IleIle隱性:OR 0.242，95%CI 0.088～0.666，P=0.006)。

表2 對照組和AD組VEGF和VEGF受體- 2 SNPs基因型和等位基因頻率

2.3 伴或不伴有CMBs的AD患者中VEGF和VEGFR2基因變異的關(guān)系 AD伴或不伴CMBs患者中VEGF和VEGFR2 SNPs的基因型和等位基因頻率見表3。在校正了年齡、性別、高血壓、糖尿病、高脂血癥、吸煙、飲酒、BMI和攜帶至少一個APOEε4等位基因后，所有檢測到的VEGF變異與AD患者CMBs無關(guān)。在校正了年齡、性別、腦血管危險因素和攜帶至少一個APOEε4等位基因后，與野生基因型相比，VEGFR2基因中的297Ile基因型與AD患者對CMBs的易感性增加相關(guān)(Vallle: OR 2.252，95%CI 1.355～3.743，P=0.002，llelle:OR 4.016，95%CI 1.598～10.093，P=0.003，Vallle+llelle 顯性:OR 2.486，95% CI 1.538～4.021，P<0.001；Vallle+llelle 隱性:OR 0.341，95% CI 0.139～0.837，P=0.019)。

表3 伴或不伴CMBs的AD患者VEGF及VEGF受體-2 SNPs基因型及等位基因頻率

2.4 血清VEGF及VEGFR2水平比較 為了探討VEGF多態(tài)性與循環(huán)VEGF水平的關(guān)系，根據(jù)VEGF多態(tài)性對AD患者血清VEGF水平進行分類。攜帶+936CT+TT基因型的AD患者平均VEGF水平低于VEGF+936CC基因型AD患者[(217.5±17.7)pg/ml VS(223.4±20.5)pg/ml,P=0.022]，見圖1。包括VEGF rs157036(-116G>A)、rs833061(-460T>C)和rs2010963(405G>C)在內(nèi)的VEGF不同基因型間的VEGF水平在AD患者中差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。檢測AD患者血清VEGFR2水平，結(jié)果顯示包括VEGFR2 rs2071559(-604T>C)、rs1870377(-1719T>A)和rs2305948(Val297Ile)在內(nèi)的不同基因型VEGFR2無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

圖1 攜帶rs3025039(+936C > T)基因型的AD患者血清VEGF水平的比較箱式圖中間的橫線代表中位數(shù)

3 討論

在中國北方漢族人群中，我們發(fā)現(xiàn)VEGFR2基因rs2305948 (Val297Ile)不僅與散發(fā)性AD的易感性相關(guān)，而且在校正年齡、性別、腦血管危險因素以及攜帶至少一個APOEε4等位基因后，與野生基因型相比，AD患者對CMBs的易感性增加。

血管系統(tǒng)功能障礙直接導(dǎo)致阿爾茨海默病的發(fā)生和發(fā)展。VEGF參與血管生成、內(nèi)皮細胞增殖和遷移，增加血管通透性，高水平的VEGF已被證明可通過誘導(dǎo)血腦屏障功能障礙而損害中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)穩(wěn)態(tài)[10]。有研究報道，VEGF基因啟動子的遺傳變異與VEGF啟動子激活和反應(yīng)性顯著不同相關(guān)，這可能影響VEGF表達水平[11]。VEGF啟動子多態(tài)性可能與AD風險相關(guān)的VEGF表達水平不同相關(guān)。VEGF rs699947 (-2578A/A)基因型與意大利人群中散發(fā)的阿爾茨海默病風險增加相關(guān)，同時不受載脂蛋白E基因型的影響[12]。在ApoEε4缺失的情況下，VEGF啟動子的-1154G等位基因和-2549D/-1154G單體型可能增加中國北方漢族人群散發(fā)型阿爾茨海默病的風險[13]。然而，在我們的研究中，只有+936C>T多態(tài)性與AD患者血清VEGF水平有弱相關(guān)。在校正了年齡、性別、高血壓、糖尿病、高脂血癥、吸煙、飲酒、BMI和攜帶至少一個APOEε4等位基因后，-116G>A、-460T>C、405G>C、+936C>T多態(tài)性與散發(fā)型AD無關(guān)。

腦血管網(wǎng)絡(luò)對于維持正常的大腦功能至關(guān)重要，由于衰老和某些神經(jīng)退行性疾病(如AD)導(dǎo)致的認知功能下降與大腦微血管的缺失有關(guān)。VEGFR2是VEGF的主要信號換能器。VEGF的結(jié)合導(dǎo)致受體二聚化以及受體激酶區(qū)自磷酸化高度激活[14]。VEGFR2介導(dǎo)內(nèi)皮細胞的增殖、遷移、通透性和存活，VEGFR2信號在調(diào)節(jié)微血管阻塞和促進年齡相關(guān)的微血管數(shù)量減少方面起著關(guān)鍵作用[15]。Ahmed-Jushuf等人[16]研究表明，在老年人的深部灰質(zhì)中，小動脈中的肌細胞VEGFR2呈強陽性，其表達程度與年齡有關(guān)，可能是年齡相關(guān)腦血管改變的一個因素。我們的研究發(fā)現(xiàn)，在VEGFR2基因中，變異體rs1870377(-1719T>A)與AD易感性增加相關(guān)。rs2305948 (Val297Ile) 變異不僅與散發(fā)性AD易感性相關(guān)，而且與AD患者CMBs易感性增加有關(guān)。Val297Ile是VEGFR2基因編碼區(qū)突變所致，位于受體蛋白的關(guān)鍵區(qū)域。rs2305948(Val297Ile)多態(tài)性等位基因與VEGFR2的結(jié)合親和力降低相關(guān)[17-18]。因此，297lle等位基因可能下調(diào)VEGF/VEGFR2信號通路的功能，導(dǎo)致血管壁發(fā)育異常，影響內(nèi)皮細胞的完整性和修復(fù)，增加CMBs的風險。

本研究有幾個局限性：首先，數(shù)據(jù)質(zhì)量可能受到樣本量小、單一醫(yī)院病例對照設(shè)計和缺乏重復(fù)研究的限制；其次，研究對象僅包括中國北方漢族人群，無法將研究結(jié)果推廣到其他民族群體；其他可能的局限性包括低估了個體風險因素的實際影響，如暴露于不同的環(huán)境因素、潛在的種族差異和額外的遺傳因素。

綜上所述，rs2305948(Val297Ile)多態(tài)性不僅增加了散發(fā)性AD的易感性風險，而且增加了AD患者患CMBs的風險。今后的研究希望著手于對其他種族人群和VEGFR2的生物學功能進行進一步的遺傳學研究，以提高我們對VEGFR2多態(tài)性在確定AD或CMBs發(fā)生風險方面作用的理解。