程 隆 朱智榮 唐桂良

1 紹興文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江省紹興市 312000； 2 浙江大學(xué)紹興醫(yī)院

精索靜脈曲張(Varicocele，VC)是指睪丸蔓狀靜脈叢迂曲擴(kuò)張、伸長(zhǎng)的一種病理現(xiàn)象。精索靜脈曲張具有發(fā)病率高、早期不易發(fā)現(xiàn)等特點(diǎn)，是引起我國男性不育的常見疾病之一[1-3],但其具體機(jī)制尚未清楚。目前研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激(Oxidative stress，OS)可產(chǎn)生過量的活性氧(Reactiveoxygenspecies，ROS)直接破壞精子細(xì)胞，導(dǎo)致睪丸組織損傷[4]。硫氧還蛋白5 (Thioredoxin domain containingprotein 5，TXNDC5) 是近年來發(fā)現(xiàn)上皮PDI家族成員之一[5],其對(duì)缺氧的內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用，可對(duì)抗VC發(fā)生發(fā)展過程中的氧化應(yīng)激損傷[6-7]。這些研究對(duì)OS導(dǎo)致精索靜脈曲張?zhí)峁┝艘粋€(gè)嶄新的思路。本研究通過構(gòu)建左側(cè)VC大鼠模型和精索靜脈曲張高位結(jié)扎術(shù)后大鼠模型，旨在探究TXNDC5在OS導(dǎo)致睪丸組織損傷中的作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 30只7周齡雄性SD大鼠(體重約 200g)，購買于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。所有動(dòng)物飼養(yǎng)在恒定的溫度[(22±2)℃], 自由進(jìn)食、進(jìn)水。本實(shí)驗(yàn)所有動(dòng)物均獲得倫理學(xué)批準(zhǔn)。

1.2 動(dòng)物分組及模型制備 將30只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法平均分入假手術(shù)組、模型組和治療組。假手術(shù)組：僅游離左精索靜脈而不進(jìn)行縮窄和結(jié)扎。模型組：根據(jù)Turner法使左腎靜脈部分狹窄。8周后再次進(jìn)入大鼠腹腔，在麻醉后顯微鏡下測(cè)量左精索靜脈直徑擴(kuò)張>1mm作為納入精索靜脈曲張大鼠模型組的標(biāo)準(zhǔn)。治療組：在模型組建立成功的基礎(chǔ)上，術(shù)后8周在顯微鏡下游離并結(jié)扎左精索靜脈，術(shù)后繼續(xù)飼養(yǎng)4周。

1.3 標(biāo)本采集 8周時(shí)假手術(shù)組和模型組大鼠取下左側(cè)睪丸，切分兩部分，一部分凍存-80℃冰箱備用，一部分浸泡于福爾馬林。治療組大鼠在靜脈結(jié)扎術(shù)后再飼養(yǎng)4周后進(jìn)行與模型組和假手術(shù)組相同的操作留取凍存標(biāo)本備用。通過HE染色觀察睪丸的病理情況和免疫組化檢測(cè)TXNDC5蛋白。

1.4 HE染色 通過4%多聚甲醛將三組大鼠睪丸組織固定24h后，常規(guī)石蠟包埋。將睪丸組織標(biāo)本切成5μm厚的切片，再經(jīng)過脫蠟, 水合，蘇木精—依紅染色后封片。采用光學(xué)顯微鏡(NIKON公司)進(jìn)行圖像采集。

1.5 免疫組化 將4%多聚甲醛固定且石蠟包埋后的三組睪丸組織標(biāo)本切成5μm厚的切片，再通過脫蠟，水合，在3%H2O2中高壓修復(fù)15min。切片用PBS 沖洗3次，在玻片的組織部位滴加TXNDC5一抗(proteintech，1∶100)置于濕盒中室溫孵育2h。再次用PBS 沖洗3次，再滴加HRP標(biāo)記光譜二抗，孵育30min。DAB染色后蘇木精復(fù)染。再使用二甲苯反復(fù)兩次沖洗染色好的玻片，中性樹膠封片后，采用光學(xué)顯微鏡(NIKON公司)進(jìn)行圖像采集。顯微鏡下棕褐色為陽性染色。染色越深，反映細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)量越高。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠睪丸組織形態(tài)觀察 根據(jù)HE染色可以觀察到，假手術(shù)組大鼠睪丸組織各曲細(xì)精管內(nèi)生精細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，層次清楚，結(jié)構(gòu)正常。模型組大鼠睪丸組織病理損傷明顯，各級(jí)生精小管排列錯(cuò)亂，生精細(xì)胞和精子細(xì)胞明顯減少。治療組大鼠睪丸組織病理損傷較輕，曲細(xì)精管層次輕度錯(cuò)亂，少量曲細(xì)精管內(nèi)生精細(xì)胞減少。見圖1。

圖1 光鏡下各實(shí)驗(yàn)組大鼠睪丸組織顯微結(jié)構(gòu)(HE×200)a.假手術(shù)組：睪丸生精細(xì)胞排列致密且完整 b.模型組：睪丸生精細(xì)胞排列錯(cuò)亂且數(shù)量減少 c.治療組：睪丸生精細(xì)胞排列正?；蜉p度錯(cuò)亂

2.2 VC下調(diào)TXNDC5的表達(dá) 根據(jù)免疫組化實(shí)驗(yàn)(見圖2)可見假手術(shù)組大鼠睪丸細(xì)胞染色最深，而模型組大鼠睪丸細(xì)胞染色最淺。由此說明假手術(shù)組大鼠睪丸組織內(nèi)TXNDC5蛋白水平較模型組大鼠較高，但通過治療大鼠睪丸組織內(nèi)TXNDC5蛋白水平有一定的升高。即精索靜脈曲張可導(dǎo)致大鼠睪丸內(nèi)TXNDC5蛋白水平降低，但通過精索靜脈高位結(jié)扎術(shù)可以上調(diào)一定的TXNDC5蛋白水平。

圖2 免疫組化檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組大鼠睪丸組織中TXNDC5的表達(dá)(HE×200)a.假手術(shù)組 b.模型組 c.治療組

3 討論

精索靜脈曲張是引起我國男性不育最常見的疾病之一，其發(fā)生機(jī)制眾多且未完全闡明[8]。其中氧化應(yīng)激學(xué)說是指機(jī)體在受到損傷時(shí)處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，過量產(chǎn)生的ROS會(huì)導(dǎo)致機(jī)體二次損傷。生理濃度的ROS有利于精子的生長(zhǎng)發(fā)育，但精索靜脈曲張時(shí)產(chǎn)生過多的ROS會(huì)導(dǎo)致抗氧化酶的平衡失調(diào)從而損傷精子[9-10]。過量的ROS會(huì)導(dǎo)致精子功能的損害。同時(shí)，受損傷的精子更容易受到ROS的攻擊，從而導(dǎo)致惡性循環(huán)，使得精子損傷進(jìn)一步加重[11]。本文構(gòu)建大鼠VC動(dòng)物模型，并研究精索靜脈曲張高位結(jié)扎術(shù)對(duì)其治療效果，結(jié)果顯示與假手術(shù)組相比較，模型組大鼠睪丸組織受到明顯病理損傷，睪丸組織形態(tài)排列錯(cuò)亂、生精細(xì)胞和精子細(xì)胞明顯減少。而通過精索靜脈高位結(jié)扎術(shù)后，可以一定程度扭轉(zhuǎn)精索靜脈曲張引起的病理損傷。由此說明VC大鼠存在一定程度的氧化應(yīng)激損傷，而這種損傷存在一定的可逆性。

TXNDC5基因作為上皮PDI基因家族成員之一。其表達(dá)的TXNDC5蛋白在抗氧化作用中起到了重要的作用。在缺氧環(huán)境下過量產(chǎn)生的ROS會(huì)導(dǎo)致HIF-1α的表達(dá)增加，HIF-1α作為細(xì)胞缺氧的分子標(biāo)志，可以保護(hù)細(xì)胞質(zhì)免受蛋白酶體的降解，從而負(fù)反饋來抑制ROS的進(jìn)程[11]。TXNDC5蛋白可以與HIF-1α結(jié)合并保持其穩(wěn)定性從而起到抗氧化作用[12]。另外，通過對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病人蛋白質(zhì)樣本的質(zhì)譜分析，確定了TXNDC5在內(nèi)源性抗氧化反應(yīng)中有調(diào)節(jié)作用[13]。TXNDC5也被證實(shí)與ERpl8在細(xì)胞中共同調(diào)節(jié)氧化還原酶的活性，是氧化還原狀態(tài)，Ca2+泵等的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白[13-14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組TXNDC5蛋白水平較假手術(shù)組相比明顯下調(diào)。說明TXNDC5蛋白水平表達(dá)失調(diào)可能是導(dǎo)致VC發(fā)生發(fā)展的一條病理通路。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示VC模型大鼠睪丸組織內(nèi)可見明顯的病理損傷。說明VC可產(chǎn)生超出機(jī)體承受范圍的ROS，從而一定程度地?fù)p傷睪丸組織及其生精細(xì)胞。同時(shí)這些損傷可通過精索靜脈高位結(jié)扎得到一定程度的扭轉(zhuǎn)。另外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦顯示VC模型大鼠TXNDC5蛋白水平下調(diào)，因此推測(cè)VC氧化應(yīng)激是通過下調(diào)TXNDC5蛋白，從而使得大鼠睪丸組織抗氧化能力降低，從而受到一定程度的氧化應(yīng)激損傷。即VC中ROS可以抑制TXNDC5蛋白表達(dá)，從而導(dǎo)致睪丸組織的損傷。但VC發(fā)生機(jī)制眾多，本文通過研究TXNDC5表達(dá)誘導(dǎo)精索靜脈曲張睪丸組織氧化應(yīng)激損傷的分子機(jī)制，希望能為闡明VC發(fā)生機(jī)制以及評(píng)估VC手術(shù)指征與術(shù)后療效提供一個(gè)新思路。