余萍 楊銀 楊發(fā)珍

(青海紅十字醫(yī)院婦科，青海 西寧 810000)

宮頸癌是全球最常見(jiàn)的婦科癌之一，2018年總共報(bào)告了570 000例宮頸癌新病例和311 000例死亡病例，成為癌癥相關(guān)死亡的第四大主要原因〔1〕。在過(guò)去的幾十年中，宮頸癌的預(yù)防和治療取得了巨大的進(jìn)步，特別是人乳頭瘤病毒(HPV)疫苗的出現(xiàn)〔2〕。然而中晚期宮頸癌患者的5年生存率并沒(méi)有顯著提高〔3〕。因此，進(jìn)一步探索宮頸癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移的分子生物學(xué)機(jī)制對(duì)于其早期預(yù)防和精準(zhǔn)治療具有重要意義。長(zhǎng)非編碼RNA(lncRNA)是一類長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸的內(nèi)源非編碼RNA。新興證據(jù)表明，lncRNA可作為微小RNA(miRNA)海綿，參與各種重要的生理和病理調(diào)節(jié)，在人類癌癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程發(fā)揮關(guān)鍵作用〔4,5〕。葡萄糖磷酸變位酶樣蛋白5反義(PGM5-AS)1在食管鱗狀細(xì)胞癌組織、血漿和細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，其過(guò)表達(dá)顯著抑制了體外食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲及體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)，作用機(jī)制與調(diào)節(jié)miR-466/第10號(hào)染色體同源丟失性磷酸酶-張力蛋白基因(PTEN)軸有關(guān)〔6〕。但尚不清楚PGM5-AS1在宮頸癌組織中的表達(dá)和確切作用。本研究的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)表明，PGM5-AS1與miR-4728-5p存在靶向結(jié)合位點(diǎn)。miR-4728-5p已被證明在乳腺癌組織中高表達(dá)，可作為癌基因調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移〔7〕。因此，本實(shí)驗(yàn)針對(duì)PGM5-AS1是否通過(guò)靶向miR-4728-5p，從而影響宮頸癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移進(jìn)行研究，以期為宮頸癌發(fā)病機(jī)制的深入探討提供新的啟示。

1 材料與方法

1.1組織、細(xì)胞與試劑 從青海紅十字醫(yī)院獲得42對(duì)經(jīng)病理學(xué)確認(rèn)的宮頸癌樣本及其相鄰的無(wú)腫瘤宮頸組織(距離腫瘤部位>5 cm處的癌旁組織)。將這些樣本在液氮中快速冷凍并保存，直至提取總RNA。獲取所有患者的知情同意書(shū)，并通過(guò)醫(yī)院臨床倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。宮頸腫瘤細(xì)胞系SiHa獲自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心ATCC。RPMI1640培養(yǎng)基獲自美國(guó)Gibco公司，Lipofectamine 2000試劑、TRIzol試劑盒獲自美國(guó)Invitrogen公司，pcDNA3.1-PGM5-AS1質(zhì)粒和對(duì)照空載質(zhì)粒pcDNA3.1、miR-4728-5p模擬物/抑制劑及各自陰性對(duì)照miR-NC、anti-miR-NC獲自上海GenePharma公司，放射免疫沉淀(RIPA)緩沖液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測(cè)試劑盒獲自Beyotime生物技術(shù)研究所，鼠抗細(xì)胞增殖抗原Ki67抗體獲自美國(guó)Santa Cruz公司，鼠抗E鈣黏蛋白(E-cadherin)抗體、鼠抗N鈣黏蛋白(N-cadherin)抗體獲自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，山羊抗鼠IgG二抗獲自美國(guó)Abcam公司，雙熒光素酶報(bào)告試劑盒獲自美國(guó)Promega公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 將SiHa細(xì)胞在RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并將1%青霉素/鏈霉素和10%胎牛血清添加到該培養(yǎng)基中。細(xì)胞生長(zhǎng)于37℃，5% CO2/95%空氣的培養(yǎng)箱。

1.3細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SiHa細(xì)胞分為pcDNA3.1組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1)，pcDNA3.1-PGM5-AS1組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-PGM5-AS1)，anti-miR-4728-5p組(轉(zhuǎn)染miR-4728-5p抑制劑anti-miR-4728-5p)，anti-miR-NC組(轉(zhuǎn)染anti-miR-NC)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)，遵循Lipofectamine 2000試劑說(shuō)明書(shū)的步驟進(jìn)行。在6孔板中接種1×105個(gè)SiHa細(xì)胞，待其生長(zhǎng)至60%匯合時(shí)，根據(jù)上述分組將pcDNA3.1-PGM5-AS1、pcDNA3.1、anti-miR-4728-5p、anti-miR-NC轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，48 h后進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)。

1.4實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)組織或細(xì)胞中PGM5-AS1、miR-4728-5p表達(dá) 根據(jù)制造商的說(shuō)明，使用TRIzol試劑盒從組織或SiHa細(xì)胞中提取用于lncRNA或miRNA測(cè)定的總RNA。使用2 μg RNA合成互補(bǔ)DNA(cDNA)。按照制造商的說(shuō)明，使用SYBR試劑盒與ABI PRISM 7500序列檢查系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行qRT-PCR分析。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)或U6分別用作PGM5-AS1和miR-4728-5p標(biāo)準(zhǔn)化的內(nèi)源對(duì)照。PGM5-AS1、miR-4728-5p的相對(duì)表達(dá)水平由2-ΔΔCt定量。使用的引物：PGM5-AS1 5′-GCCCTACCAGGAGTGAATGA-3′(正義鏈)和5′-TTCCTGGTTTTGGAGTTTGG-3′(反義鏈)。miR-4728-5p 5′-GTGGGAGGGGAGAGGCA-3′(正義鏈)和5′-GTCAGCATGCTAGTCCCAGG-3′(反義鏈)。GAPDH 5′-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3′(正義鏈)和5′-TTCAGCTCAGGGATGACCTT-3′(反義鏈)。U6 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′(正義鏈)和5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′(反義鏈)。

1.5噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)SiHa細(xì)胞的增殖 將轉(zhuǎn)染的SiHa細(xì)胞以1×104個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種在96孔板中。培養(yǎng)48 h后，加入20 μl MTT溶液孵育4 h，之后加入二甲基亞砜，劇烈震蕩10 min，于酶標(biāo)儀測(cè)定細(xì)胞在490 nm處的吸光度OD值，計(jì)算細(xì)胞存活率(%)。

1.6平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SiHa細(xì)胞的克隆形成 將轉(zhuǎn)染的SiHa細(xì)胞以500個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種在6孔板中。培養(yǎng)2 w后，將克隆的細(xì)胞用4%多聚甲醛固定20 min，并在室溫下用0.5%結(jié)晶紫染色15 min。在Olympus倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)大于50的細(xì)胞克隆形成數(shù)。

1.7Western印跡檢測(cè)SiHa細(xì)胞中Ki67、E-cadherin、N-cadherin蛋白表達(dá) 收集轉(zhuǎn)染的SiHa細(xì)胞，用RIPA緩沖液裂解，獲得細(xì)胞蛋白。根據(jù)制造商的協(xié)議，使用BCA試劑盒對(duì)蛋白進(jìn)行定量。通過(guò)12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質(zhì)(30 μg/泳道)。將分離的蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，并在室溫下用5%封閉液封閉1 h。用相應(yīng)的Ki67、E-cadherin、N-cadherin和對(duì)照GAPDH一抗(均為1∶1 000稀釋)標(biāo)記膜，并在4℃下孵育過(guò)夜。第2天將膜與山羊抗鼠IgG二抗(1∶10 000稀釋)在室溫下孵育1 h。使用電化學(xué)發(fā)光(ECL)液顯示蛋白條帶，分析Ki67、E-cadherin、N-cadherin蛋白表達(dá)。

1.8Transwell小室法檢測(cè)SiHa細(xì)胞的遷移、侵襲 將轉(zhuǎn)染后的SiHa細(xì)胞懸浮于無(wú)血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，并調(diào)節(jié)至3×104個(gè)細(xì)胞/ml的密度。在Transwell小室的上腔室中接種100 μl細(xì)胞懸液，下腔室中添加600 μl含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，在5% CO2下于37℃孵育。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，將遷移細(xì)胞在室溫下用100%甲醇固定20 min，并用0.5%結(jié)晶紫染色10 min，在光學(xué)顯微鏡觀察遷移細(xì)胞的數(shù)目。對(duì)于侵襲測(cè)定，實(shí)驗(yàn)前，上室用與無(wú)血清培養(yǎng)基混勻的Matrigel基質(zhì)膠涂覆，其余步驟同遷移測(cè)定。

1.9雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證PGM5-AS1對(duì)miR-4728-5p的靶向調(diào)控 通過(guò)Starbase(http://starbase.sysu.edu.cn/)預(yù)測(cè)了PGM5-AS1與miR-4728-5p結(jié)合序列。將含有假定的miR-4728-5p結(jié)合位點(diǎn)的PGM5-AS1片段克隆到pmirGLO載體中，構(gòu)建野生型PGM5-AS1(WT-PGM5-AS1)，同樣構(gòu)建帶有突變位點(diǎn)片段的突變型PGM5-AS1(MUT-PGM5-AS1)報(bào)告基因。然后將構(gòu)建的報(bào)告基因分別與miR-4728-5p模擬物或miR-NC共轉(zhuǎn)染到SiHa細(xì)胞中，分別記為miR-4728-5p組或miR-NC組。48 h后通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告試劑盒測(cè)定相對(duì)熒光素酶活性。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1PGM5-AS1在宮頸癌中的表達(dá) 如表1所示，與癌旁組織組(1.04±0.12)相比，42例宮頸癌組織中PGM5-AS1的表達(dá)水平明顯降低(0.20±0.01，P<0.05)。

2.2PGM5-AS1對(duì)SiHa增殖的影響 如表1、圖1所示，與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-PGM5-AS1組SiHa細(xì)胞中PGM5-AS1表達(dá)量明顯增加，細(xì)胞存活率和克隆形成數(shù)顯著減少，并且Ki67蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。

2.3PGM5-AS1對(duì)SiHa遷移、侵襲的影響 如表1、圖2所示，與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-PGM5-AS1組的SiHa細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)明顯減少，E-cadherin蛋白表達(dá)量顯著增加，N-cadherin蛋白水平明顯降低(P<0.05)。

表1 PGM5-AS1對(duì)SiHa增殖、遷移、侵襲的影響

圖1 兩組Ki67蛋白的表達(dá)

圖2 兩組E-cadherin、N-cadherin蛋白的表達(dá)

2.4PGM5-AS1靶向miR-4728-5p Starbase在線預(yù)測(cè)結(jié)果如圖3所示，PGM5-AS1與miR-4728-5p具有靶向結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，與轉(zhuǎn)染miR-NC相比，轉(zhuǎn)染miR-4728-5p明顯降低轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-PGM5-AS1的SiHa細(xì)胞熒光素酶活性(P<0.05)，對(duì)轉(zhuǎn)染MUT-PGM5-AS1的SiHa細(xì)胞熒光素酶活性無(wú)顯著影響(P>0.05)。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染pcDNA3.1相比，轉(zhuǎn)染pcD-NA3.1-PGM5-AS1后SiHa細(xì)胞中miR-4728-5p表達(dá)水平明顯降低(1.02±0.04 vs 0.38±0.02，P<0.05)。

圖3 PGM5-AS1靶向miR-4728-5p

表2 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

2.5抑制miR-4728-5p對(duì)SiHa增殖的影響 如圖4、表3所示。與anti-miR-NC組相比，anti-miR-4728-5p組明顯減少miR-4728-5p表達(dá)量、細(xì)胞存活率、克隆形成數(shù)、Ki67蛋白表達(dá)量(P<0.05)。

圖4 兩組Ki67蛋白的表達(dá)

表3 抑制miR-4728-5p對(duì)SiHa增殖、遷移、侵襲的影響

2.6抑制miR-4728-5p對(duì)SiHa遷移侵襲的影響 如表3、圖5所示，與anti-miR-NC組相比，anti-miR-4728-5p組SiHa細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)、N-cadherin蛋白表達(dá)量降低，E-cadherin蛋白水平提高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

圖5 兩組E-cadherin、N-cadherin蛋白的表達(dá)

3 討 論

子宮切除術(shù)及放化療是治療早期宮頸癌的最廣泛的治療手段〔8〕。然而，由于復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，宮頸癌患者的預(yù)后仍然不能令人滿意〔9〕?，F(xiàn)階段，宮頸癌的分子基礎(chǔ)尚未得到很好的闡明。更深入地了解宮頸癌發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制將有助于發(fā)現(xiàn)新型的分子治療靶標(biāo)。越來(lái)越多的數(shù)據(jù)突出了lncRNA在宮頸癌腫瘤進(jìn)展，侵襲和轉(zhuǎn)移，細(xì)胞凋亡和放射抵抗等方面的重要性〔10,11〕。本研究揭示了宮頸癌組織中l(wèi)ncRNA PGM5-AS1表達(dá)水平的變化及對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，結(jié)果證實(shí)，PGM5-AS1具有抑制宮頸癌進(jìn)展的作用，另外，其機(jī)制與抑制miR-4728-5p表達(dá)有關(guān)。

lncRNA是癌癥發(fā)展和進(jìn)展的基本調(diào)節(jié)劑，可能在宮頸癌進(jìn)程中充當(dāng)癌基因或抑癌基因。本項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)PGM5-AS1在宮頸癌組織中表達(dá)下調(diào)。最近，PGM5-AS1被發(fā)現(xiàn)參與乳腺癌〔12〕、胃癌〔13〕、黑色素瘤〔14〕等一些腫瘤的進(jìn)展。例如，Qian等〔15〕報(bào)告，透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌組織中PGM5-AS1的表達(dá)低于匹配的非腫瘤標(biāo)本，其下調(diào)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，PGM5-AS1是透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素。張霖等〔16〕證明PGM5-AS1在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)下調(diào)，可以抑制細(xì)胞的克隆增殖能力，發(fā)揮一定抗癌作用。與相應(yīng)的正常組織相比，結(jié)直腸癌組織中PGM5-AS1的表達(dá)水平顯著下調(diào)，在功能上，PGM5-AS1的過(guò)表達(dá)可誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞周期停滯，還可抑制體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)〔17〕。這些研究證實(shí)，PGM5-AS1可能是潛在的腫瘤抑制劑。然而，PGM5-AS1在宮頸癌中的功能和機(jī)制尚不清楚。本研究的功能實(shí)驗(yàn)測(cè)定顯示，PGM5-AS1過(guò)表達(dá)抑制宮頸癌SiHa細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并抑制細(xì)胞增殖抗原Ki67和遷移侵襲相關(guān)蛋白N-cadherin表達(dá)，促進(jìn)E-cadherin蛋白表達(dá)。這表明，PGM5-AS1在宮頸癌中起著抑癌lncRNA的作用，與前人報(bào)道〔16,17〕相同。

證據(jù)表明，lncRNA可作為miRNA海綿調(diào)節(jié)腫瘤進(jìn)展〔18〕。如lncRNA PTENP1通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-106b抑制宮頸癌的進(jìn)展，導(dǎo)致細(xì)胞增殖減少和細(xì)胞凋亡增加〔19〕，lncRNA CRNDE通過(guò)海綿化miR-183調(diào)節(jié)CCNB1表達(dá)，在宮頸癌中起癌基因的作用，促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲〔20〕。本研究生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)闡明了miR-4728-5p是PGM5-AS1的靶基因，并且宮頸癌SiHa細(xì)胞miR-4728-5p的表達(dá)水平被PGM5-AS1所抑制。提示宮頸癌中的PGM5-AS1可能通過(guò)調(diào)控miR-4728-5p發(fā)揮抗腫瘤活性。近年來(lái)，一些研究表明了miR-4728-5p可能在腫瘤進(jìn)展中起促癌作用〔7〕。但是，其對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的作用仍然未知。在這項(xiàng)研究中，顯示抑制miR-4728-5p減少SiHa細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，與其在乳腺癌〔7〕中的作用相同。

綜上所述，PGM5-AS1是宮頸癌中的一種新型腫瘤抑制因子，可以靶向抑制miR-4728-5p的表達(dá)，從而抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。