陸輝志 付守芝 譚赟 曹松 董輝 楊璐瑜
(武漢市第三醫(yī)院重癥醫(yī)學科,湖北 武漢 430071)
慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種常見的可預防、可治療的疾病,有害顆?;蛘邭怏w造成的肺組織及呼吸道中慢性炎癥是其發(fā)生的重要原因〔1〕。與COPD發(fā)生有關(guān)的靶細胞有多個,其中肺成纖維細胞和氣道重塑關(guān)系密切〔2〕。在正常生理狀態(tài)下,多數(shù)的肺成纖維細胞處于靜息狀態(tài),而受到病理條件的刺激以后,肺成纖維細胞向炎癥部位聚集,產(chǎn)生大量的炎癥因子和炎癥介質(zhì),同時細胞凋亡水平增加,造成組織損傷〔3〕。吸煙是誘導COPD發(fā)生的致病因素之一,肺成纖維細胞對香煙的煙霧較為敏感,香煙煙霧提取物(CSE)能夠抑制肺成纖維細胞增殖,誘導細胞分泌炎癥因子,促進細胞凋亡,造成細胞損傷〔4〕。微小RNA(miRNA)在人體內(nèi)的幾乎所有組織中均有表達,miRNA具有多種作用,參與生命體正常生理和病理過程,如細胞生長、凋亡、分化、代謝、糖尿病、腫瘤等〔5,6〕。miR-212-5p參與癌癥、帕金森的發(fā)生〔7,8〕。有研究表明,miR-212-5p能夠抑制心臟成纖維細胞增殖,在心肌纖維化中發(fā)揮抑制作用〔9〕。既往實驗發(fā)現(xiàn),miR-212-5p與COPD有關(guān),miR-212-5p在COPD中表達下調(diào),其能夠抑制CSE誘導的氣道上皮細胞凋亡〔10〕。目前對于miR-212-5p在CSE誘導的肺成纖維細胞炎癥因子分泌和凋亡中的作用還不明確。本研究旨在探討miR-212-5p在CSE誘導的肺成纖維細胞炎癥因子分泌和凋亡中的作用和機制。
1.1材料 C-半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology;腫瘤壞死因子(TNF)-α含量檢測試劑盒購自深圳市科潤達生物工程有限公司;核因子(NF)-κB p65抗體購自美國Abcam;人胚肺成纖維細胞(MRC-5)購自無錫欣潤生物科技有限公司;白細胞介素(IL)-8含量檢測試劑盒購自上??道噬锟萍加邢薰荆籱iR-212-5p mimics和mimics control購自百奧邁科生物技術(shù)有限公司;IL-1β含量檢測試劑盒購自武漢艾美捷科技有限公司。
1.2實驗分組處理 MRC-5培養(yǎng)在含有10 ml/L鏈霉素和青霉素、10%胎牛血清的MEM細胞培養(yǎng)液中,細胞放在含有5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),每48 h更換一次細胞培養(yǎng)液,細胞密度生長至70%以上,添加0.25%的胰蛋白酶消化傳代。MRC-5中轉(zhuǎn)染miR-212-5p mimics和mimics control,培養(yǎng)12 h以后,更換成含有5%的CSE細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),分別命名為CSE+miR-212-5p組和CSE+miR-NC組。細胞轉(zhuǎn)染方法按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000的操作說明書進行。將沒有轉(zhuǎn)染的MRC-5細胞用含有5%的CSE細胞培養(yǎng)液培養(yǎng),命名為CSE組。把正常培養(yǎng)的MRC-5細胞設(shè)置為Control組。CSE的制備方法參照文獻〔4〕,以煙霧發(fā)生器用去過濾嘴香煙負壓抽吸,在出煙口的位置連接一根導管,使煙霧進入MEM中,然后用NaOH及HCL將pH調(diào)整到7.4,以0.22 pm的濾器過濾之后,為100%的CSE,在實驗時根據(jù)要求稀釋成5%的CSE。
1.3miR-212-5p表達檢測 用實時熒光定量PCR(qPCR)方法檢測miR-212-5p表達。對照組、CSE組、CSE+miR-NC組、CSE+miR-212-5p組細胞培養(yǎng)24 h以后,在細胞內(nèi)添加Trizol,分別提取各組細胞中的總RNA。用TE溶液對分光光度計進行校正,然后檢測提取的RNA的OD260和OD280的比值。取RNA,進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),配制的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系如下:1 μg的RNA、1 μl的oligo(dT)中添加RNase free water至10 μl,在65℃反應(yīng)5 min,然后繼續(xù)加入1 μl的RNase抑制劑、1 μl的RT-primer、2 μl的dNTP mix,在42℃反應(yīng)60 min,70℃反應(yīng)5 min,4℃保存。PCR引物序列為:U6上游引物:CGAGCAGAGTCGCTTCA,下游:CTCGCTTCGGCAGCACATAT;miR-212-5p上游引物:CCTCGACTGGGGGTGTAAACAT,下游:-GTGGAGTCGATTGCGTGTC-3。收集1 μl的cDNA,添加0.5 μl的上游引物和下游引物、10 μl的SYBR Green master mix、8 μl的無水RNase,在95℃預變性8 min,95℃反應(yīng)30 s,95℃反應(yīng)5 s,60℃反應(yīng)30 s,共進行40個循環(huán)。結(jié)果按照2-△△Ct法計算miR-212-5p的表達變化,U6為內(nèi)參。
1.4細胞分泌炎癥因子檢測 用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測炎癥因子IL-1β、IL-8、TNF-α水平。對照組、CSE組、CSE+miR-NC組、CSE+miR-212-5p組細胞培養(yǎng)24 h以后,收集細胞培養(yǎng)液上清,用IL-1β含量檢測試劑盒、IL-8含量檢測試劑盒、TNF-α含量檢測試劑盒測定培養(yǎng)液上清中IL-1β、IL-8、TNF-α水平。
1.5細胞增殖活性檢測 用CCK-8法檢測細胞增殖活性。MRC-5接種到96孔板中,接種的密度為4×105個/ml,每個孔內(nèi)添加150 μl的細胞懸浮液。按照對照組、CSE組、CSE+miR-NC組、CSE+miR-212-5p組分組方法處理并培養(yǎng)24 h以后,將細胞培養(yǎng)板取出,然后吸取10 μl的CCK-8工作溶液添加到每個孔內(nèi),將培養(yǎng)板再次放在37℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 h。將酶標儀的波長設(shè)置為450 nm,測定每個孔的OD值,OD值表示細胞增殖活性。
1.6細胞凋亡變化檢測 用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡變化。對照組、CSE組、CSE+miR-NC組、CSE+miR-212-5p組細胞培養(yǎng)24 h以后,用胰蛋白酶消化細胞,2 600 r/min離心10 min后,將細胞收集,在細胞沉淀內(nèi)添加適量的磷酸鹽緩沖液(PBS)將細胞反復洗滌2次,然后在細胞內(nèi)添加結(jié)合緩沖溶液400 μl,繼續(xù)添加膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和碘化丙啶(PI)工作溶液各5 μl,避光反應(yīng)20 min以后,將細胞置于流式細胞儀中檢測凋亡水平。
1.7Western印跡檢測細胞中C-Caspase-3、NF-κB p65蛋白表達 空白組、CSE組、CSE+miR-NC組、CSE+miR-212-5p組細胞培養(yǎng)24 h以后,用胰蛋白酶消化細胞,2 600 r/min離心10 min后,將細胞收集。在細胞內(nèi)添加提前加入PMSF的放射免疫沉淀法(RIPA)溶液,然后放在冰上充分裂解30 min。將裂解溶液轉(zhuǎn)移到4℃離心機中,設(shè)置2 600 r/min離心10 min,將上清溶液收集并保存,蛋白存在于上清溶液中。吸取少量的蛋白溶液,用二喹啉甲酸(BCA)方法測定蛋白的濃度以后,在剩余的蛋白溶液中添加上樣緩沖液,煮沸5 min。制備十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),電泳電壓設(shè)置為:濃縮膠80 V,分離膠100 V,溴酚藍染料跑到底部之后,停止電泳。將凝膠取出并洗滌,放在轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡。將聚偏氟乙烯(PVDF)膜根據(jù)目的蛋白在凝膠中的位置裁剪,同樣浸泡在轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡。在冰上以60 V的電壓轉(zhuǎn)膜30 min。將PVDF膜取出,然后放在已經(jīng)添加5%牛血清白蛋白的容器內(nèi),在室溫中結(jié)合2 h。PVDF膜經(jīng)TBST洗滌以后,再放在含有稀釋以后的一抗孵育袋中,于4℃溫度條件下結(jié)合過夜。再次用TBST將PVDF膜取出,然后放在含有稀釋以后的二抗孵育袋中,在室溫中結(jié)合2 h。按照電化學發(fā)光(ECL)顯色試劑盒顯色。GAPDH作為參照,分析目的蛋白的表達差異。
1.8NF-κB信號激活劑對miR-212-5p的作用檢測 取轉(zhuǎn)染miR-212-5p mimics以后的MRC-5細胞,用含有1 μmol/L的NF-κB信號激活劑PMA和5%的CSE細胞培養(yǎng)液培養(yǎng),命名為CSE+miR-212-5p+PMA組,以CSE+miR-212-5p組為參照,利用ELISA(按照1.4中步驟操作)、CCK-8(按照1.5中步驟操作)、流式細胞術(shù)(按照1.6中步驟操作)、Western印跡法(按照1.7中步驟操作)分別檢測細胞分泌的IL-1β、IL-8、TNF-α水平和細胞增殖、凋亡及C-Caspase-3、NF-κB p65蛋白表達變化。
1.9統(tǒng)計學方法 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗、方差分析。
2.1miR-212-5p mimics提高CSE誘導的MRC-5細胞中miR-212-5p表達水平 CSE組MRC-5細胞中的miR-212-5p表達水平明顯低于對照組(P<0.05);CSE+miR-212-5p組MRC-5細胞中的miR-212-5p表達水平明顯高于CSE+miR-NC組(P<0.05)。見表1。
2.2miR-212-5p對CSE誘導的MRC-5細胞炎癥因子表達影響 CSE組MRC-5細胞分泌的IL-1β、IL-8、TNF-α水平明顯高于Control組(P<0.05);CSE+miR-212-5p組MRC-5細胞分泌的IL-1β、IL-8、TNF-α水平明顯低于CSE+miR-NC組(P<0.05)。見表1。
2.3miR-212-5p對CSE誘導的MRC-5細胞增殖和凋亡影響 與Control組比較,CSE組MRC-5細胞增殖活性明顯降低,細胞凋亡率和C-Caspase-3蛋白水平明顯升高(P<0.05);與CSE+miR-NC組比較,CSE+miR-212-5p組MRC-5細胞增殖活性明顯升高,細胞凋亡率明顯、C-Caspase-3蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)。見表1、圖1、圖2。
表1 miR-212-5p mimics轉(zhuǎn)染以后CSE誘導的MRC-5細胞miR-212-5p表達、分泌的IL-1β、IL-8、TNF-α水平、增殖活性、 凋亡率、NF-κB p65蛋白和C-Caspase-3蛋白水平
圖1 流式細胞術(shù)檢測MRC-5細胞凋亡
1~4:Control組,CSE組,CSE+miR-NC組,CSE+miR-212-5p組,圖3同圖2 Western印跡檢測MRC-5細胞中 C-Caspase-3蛋白表達
2.4miR-212-5p對CSE誘導的MRC-5細胞NF-κB信號通路的影響 CSE組MRC-5細胞中NF-κB p65蛋白表達水平明顯高于Control組(P<0.05);CSE+miR-212-5p組MRC-5細胞中NF-κB p65蛋白表達水平明顯低于CSE+miR-NC組(P<0.05)。見表1、圖3。
圖3 Western印跡檢測各組NF-κB p65蛋白表達
2.5NF-κB信號激活劑對miR-212-5p影響CSE誘導條件下MRC-5細胞增殖、凋亡和分泌炎癥因子的作用 與CSE+miR-212-5p組比較,CSE+miR-212-5p+PMA組細胞中NF-κB p65蛋白水平明顯升高,細胞增殖活性明顯降低,細胞凋亡率明顯升高,細胞中C-Caspase-3蛋白表達明顯增多,細胞分泌的IL-1β、IL-8、TNF-α明顯增多(均P<0.001)。見圖4、表2。
1,2:CSE+miR-212-5p組,CSE+miR-212-5p+PMA組
表2 NF-κB信號激活劑處理的轉(zhuǎn)染miR-212-5p mimics以后的CSE誘導條件下 MRC-5細胞增殖活性、凋亡率及C-Caspase-3、NF-κB p65蛋白水平和分泌的IL-1β、IL-8、TNF-α水平
肺成纖維細胞參與氣道重塑過程。在氣道重塑中,肺成纖維細胞產(chǎn)生大量的細胞因子如炎癥因子,增加肺組織炎癥反應(yīng),促進疾病進展〔11〕。CSE是肺成纖維細胞損傷的主要原因,CSE誘導肺成纖維細胞炎癥因子釋放、增殖抑制、細胞凋亡〔4〕。細胞釋放的炎癥因子一方面促進組織炎癥損傷,另一方面還可以激活細胞凋亡途徑,誘導細胞凋亡發(fā)生〔12〕。IL-1β、IL-8、TNF-α是常見的肺成纖維細胞分泌的炎癥因子,其表達水平越高,炎癥水平也就越高〔13〕。Caspase是與細胞凋亡有關(guān)的調(diào)控蛋白家族,其成員較多,在細胞凋亡中發(fā)揮促進作用〔14〕。Caspase蛋白成員在正常情況下以沒有活性的酶原形式存在于細胞內(nèi),只有被激活后才可以誘導細胞凋亡的發(fā)生〔15〕。Caspase-3是細胞凋亡的執(zhí)行因子,也是Caspase凋亡反應(yīng)的下游因子,其活化后是細胞凋亡發(fā)生的重要標志之一〔16〕。本研究結(jié)果說明,CSE誘導肺成纖維MRC-5細胞凋亡和炎癥因子釋放,成功構(gòu)建了肺成纖維細胞體外損傷模型。
miRNA是一類沒有編碼蛋白質(zhì)功能的小分子RNA,沒有開放閱讀框,長度大約為20 nt,miRNA在多種生命體內(nèi)均有表達,并且其參與調(diào)控不同細胞生長、分化、能量代謝、衰老等過程〔17〕。miRNA還是一個與疾病進展有關(guān)的多功能調(diào)控因子,在不同的病理過程中的作用不同〔18〕。有研究表明,miRNA與慢性阻塞性肺疾病進展有關(guān),在肺組織炎癥、細胞凋亡等過程中發(fā)揮關(guān)鍵功能〔19〕。miR-212-5p是一個多功能調(diào)控因子,廣泛參與正常生理和病理過程,如miR-212-5p具有保護神經(jīng)細胞損傷的作用,miR-212-5p在癌癥進展中發(fā)揮抑制作用〔20,21〕。以前的研究發(fā)現(xiàn),miR-212-5p參與成纖維細胞增殖調(diào)控,miR-212-5p在心肌梗死后心肌成纖維細胞中表達下調(diào),并且miR-212-5p能夠抑制心肌成纖維細胞增殖〔9〕。在慢性阻塞性肺疾病患者中發(fā)現(xiàn)miR-212-5p表達下調(diào),且上調(diào)miR-212-5p具有改善疾病損傷的功能〔10〕。本實驗顯示,CSE誘導的MRC-細胞中miR-212-5p表達下調(diào),并且上調(diào)miR-212-5p抑制CSE誘導的MRC-5細胞增殖抑制,凋亡促進和炎癥因子分泌作用,miR-212-5p有改善CSE誘導的肺成纖維細胞炎癥因子表達和細胞凋亡作用,這與以前的研究結(jié)果〔10〕相符合,說明miR-212-5p可能是COPD保護因子。
NF-κB是一種從淋巴B細胞中發(fā)現(xiàn)的核轉(zhuǎn)錄因子,在幾乎所有的真核細胞中均有表達,NF-κB p65是NF-κB信號轉(zhuǎn)導的關(guān)鍵亞單位,其表達水平的高低與NF-κB信號激活水平相關(guān)〔22〕。NF-κB是機體炎癥反應(yīng)的樞紐,與炎癥因子分泌關(guān)系十分密切。另外,NF-κB還與細胞凋亡、細胞生長、穩(wěn)態(tài)維持等有關(guān)〔23〕。研究發(fā)現(xiàn),NF-κB在COPD疾病小氣道重塑中發(fā)揮作用,NF-κB促進肺成纖維細胞分泌炎癥因子和細胞凋亡〔24〕。本研究結(jié)果提示,miR-212-5p作用機制與NF-κB有關(guān)。