賈冬雪 杜靜 王書華

(1河北北方學(xué)院藥學(xué)系，河北 張家口 075000；2河北華奧醫(yī)院有限公司；3河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院)

腦卒中是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡和長期殘疾的主要原因之一，其中因腦循環(huán)血管阻塞引發(fā)的缺血性腦卒中最為常見〔1，2〕。當(dāng)積極采取措施恢復(fù)腦缺血區(qū)的血流供應(yīng)后，缺血腦組織反而受到更嚴(yán)重的二次損傷的現(xiàn)象稱為腦缺血再灌注損傷。線粒體是存在于真核生物體內(nèi)一種細(xì)胞器，在細(xì)胞多種生命調(diào)控活動中均具有至關(guān)重要作用，與腦缺血再灌注損傷具有密切關(guān)聯(lián)〔3〕。血液供應(yīng)恢復(fù)使得細(xì)胞產(chǎn)生大量的活性氧，氧化還原系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)被破壞，活性氧大量蓄積引發(fā)氧化應(yīng)激損傷，作為活性氧主要來源和首要攻擊目標(biāo)的線粒體受損嚴(yán)重。功能異常的線粒體不僅不能為細(xì)胞提供所需的能量，還會觸發(fā)線粒體凋亡通路，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡〔4〕。由此可見保證線粒體功能正常對減輕腦缺血再灌注損傷具有重要的意義。

線粒體自噬是一個(gè)選擇性包裹受損線粒體形成自噬體并利用溶酶體將其降解的過程，從而避免功能異常的線粒體對細(xì)胞造成損傷〔5，6〕。但也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)血液復(fù)灌可導(dǎo)致線粒體自噬過度激活，加重腦缺血再灌注損傷，抑制線粒體自噬對腦組織具有保護(hù)作用〔7〕。葒草苷是金蓮花、葒草等中藥植物中的主要有效活性成分，具有抗炎、抗血栓、抑制腫瘤生長等藥理作用〔8〕。前期研究表明，葒草苷可減輕腦缺血再灌注大鼠腦組織損傷，其可能與抗炎、降低興奮性氨基酸對神經(jīng)細(xì)胞毒性、抑制氧化應(yīng)激損傷等機(jī)制有關(guān)〔9〕。但葒草苷是否通過調(diào)控線粒體自噬發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用仍不清楚，本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，探討線粒體自噬在葒草苷減輕大鼠腦缺血再灌注損傷中的作用。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 SPF級健康SD雄性大鼠，體重250～280 g，購自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司。動物許可證號：SCXK(京) 2019-0010。

1.2藥品與試劑 葒草苷(純度：99.60%)，南通飛宇生物科技有限公司生產(chǎn)；雷帕霉素購自美國BioVision公司；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和鈣離子(Ca2+)含量測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；微管相關(guān)蛋白輕鏈3抗體(LC3)，日本MBL公司生產(chǎn)；B細(xì)胞淋巴瘤-2基因(Bcl-2)/E1B-19K相互作用蛋白3抗體(BNIP3)，ABclonal公司生產(chǎn)；細(xì)胞色素c氧化酶Ⅳ亞型1抗體(COX Ⅳ)，杭州華安生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.3儀器 Tacan Safire2多功能酶標(biāo)儀，奧地利Tecan公司產(chǎn)品；3K30 超速冷凍離心機(jī)，德國 Sigma 公司產(chǎn)品；FM0530多色熒光和化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，ProteinSimple公司產(chǎn)品。

1.4用線栓法制備大鼠局灶性腦中動脈阻斷模型 采用改良Longa線栓法〔10〕制備MCAO模型，在缺血2 h后，慢慢拔出栓線進(jìn)行血液再灌注。假手術(shù)組大鼠只分離血管，不進(jìn)行插線處理。術(shù)后1 h參照Longa 5分制評分法對大鼠進(jìn)行評分，評分越高，說明大鼠腦損傷越嚴(yán)重，評分1～3分表明 MCAO 模型的成功建立。

1.5分組與給藥 將模型制備成功的大鼠隨機(jī)分為：模型組、葒草苷組、葒草苷+雷帕霉素組，另取未插線的大鼠為假手術(shù)組，每組18只。葒草苷組于術(shù)后1 h和12 h腹腔注射6.48 μmol/kg葒草苷溶液2次(課題組前期研究〔11〕證明葒草苷6.48 μmol/kg劑量組對腦缺血再灌注大鼠具有較好的治療效果)，假手術(shù)組和模型組給予同等劑量的溶劑和0.9%NaCl混合溶液。葒草苷+雷帕霉素組于術(shù)前24 h和30 min給予2.66 mg/ml雷帕霉素溶液兩次〔12〕。

1.6腦缺血再灌大鼠神經(jīng)功能損傷評分 再灌注24 h后，參照Zea-Longa建立的5分制評分法對各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分，通過觀察雙側(cè)肢體肌力大小、大鼠肢體動作的協(xié)調(diào)性及探索能力，對大鼠的神經(jīng)功能損傷程度做直觀評估，分?jǐn)?shù)越高，神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重。0分：大鼠肢體運(yùn)動正常，無明顯行為學(xué)改變；1分：大鼠左前爪蜷曲，不能完全舒展；2分：大鼠左側(cè)抗側(cè)推能力明顯減弱，肩內(nèi)收，走路時(shí)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：行走時(shí)向左側(cè)傾斜搖擺不定；4分：意識模糊，不能自發(fā)行走。

1.7TTC法測定腦梗死體積 腦缺血再灌注24 h，深度麻醉后斷頭取腦，按照文獻(xiàn)〔9〕操作進(jìn)行染色，染色完成后正常組織為紅色，而梗死部分則呈現(xiàn)為白色，放入4%多聚甲醛溶液中固定24 h后拍照，用ImageJ軟件分析腦梗死體積百分比。為排除腦水腫對腦梗死體積測定結(jié)果的影響，采用校正后的公式計(jì)算腦梗死體積：腦梗死體積百分比=(缺血側(cè)對側(cè)正常腦組織體積-缺血側(cè)正常腦組織體積)/缺血側(cè)對側(cè)正常腦組織體積×100%。

1.8分光光度法測定線粒體SOD酶活性及Ca2+和MDA含量 大鼠再灌注24 h，深度麻醉后斷頭取腦，小心分離出缺血側(cè)腦皮質(zhì)，稱取適量的腦組織，剪碎后加入線粒體分離液A(組織：線粒體分離液A=1∶10)制備勻漿液，于700 r/min，4℃條件下離心5 min，小心吸取上清液，于12 400 r/min，4℃條件下離心10 min，離心管底部沉淀即為所需的線粒體，上述操作需在4℃下進(jìn)行。加入適量的線粒體裂解液(組織：裂解液=1∶2)，反應(yīng)20 min后，參照測定試劑盒操作說明書測定線粒體中SOD酶活性及Ca2+和MDA含量。

1.9Western印跡測定缺血腦組織中純化線粒體LC3和BNIP3的表達(dá)情況 前期處理同1.8，將裂解后的線粒體于13 500 r/min，4℃條件下離心10 min，上清即為所需的線粒體蛋白，測定蛋白濃度后金屬浴變性制備上樣樣品，以COXⅣ表達(dá)為內(nèi)參，通過計(jì)算目標(biāo)蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和BNIP3和內(nèi)參的比值反映各組蛋白的表達(dá)水平。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組神經(jīng)功能損傷評分的測定情況 假手術(shù)組肢體運(yùn)動無明顯改變，評分為0分；與假手術(shù)組比較，模型組出現(xiàn)明顯肢體運(yùn)動障礙，評分明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，葒草苷治療后肢體運(yùn)動情況明顯改善，評分顯著降低(P<0.05，P<0.01)；與葒草苷組相比，葒草苷+雷帕霉素組神經(jīng)功能損傷評分升高，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組神經(jīng)功能損傷評分、腦梗死體積、SOD活性、Ca2+和MDA含量及LC3和BNIP3蛋白表達(dá)比較

2.2各組腦梗死體積的測定情況 與假手術(shù)組相比，模型組腦梗死體積顯著增加(P<0.01)；與模型組比，葒草苷組腦梗死體積明顯降低(P<0.05，P<0.01)；與葒草苷組相比，葒草苷+雷帕霉素組腦梗死體積顯著增加(P<0.05)。見表1、圖1。

圖1 各組腦梗死體積

2.3各組腦組織線粒體SOD酶活性及Ca2+和MDA含量 與假手術(shù)組相比，模型組缺血側(cè)腦組織的線粒體中SOD酶活性顯著降低(P<0.01)，而MDA和Ca2+含量則明顯增加(P<0.01)；與模型組相比，葒草苷組明顯增強(qiáng)大鼠腦線粒體中SOD活性(P<0.01)，明顯降低MDA和Ca2+含量(P<0.05，P<0.01)；與葒草苷組比較，葒草苷+雷帕霉素組明顯降低SOD酶活性(P<0.05)，而MDA和Ca2+含量明顯增加(P<0.05)。見表1。

2.4各組腦組織線粒體中LC3和BNIP3蛋白表達(dá) 與假手術(shù)組相比，模型組缺血側(cè)腦組織的線粒體中LC3和BNIP3蛋白的相對表達(dá)量顯著增加(P<0.01)；與模型組相比，葒草苷組腦線粒體中LC3和BNIP3蛋白的相對表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)；與葒草苷組相比，葒草苷+雷帕霉素能明顯增加大鼠腦線粒體中LC3和BNIP3蛋白的相對表達(dá)(P<0.05)。見表1、圖2。

1～4：假手術(shù)組、模型組、葒草苷組、葒草苷+雷帕霉素組圖2 各組腦線粒體LC3和BNIP3蛋白表達(dá)

3 討 論

線粒體通過氧化磷酸化為細(xì)胞提供能量同時(shí)，在活性氧(ROS)產(chǎn)生、鈣動態(tài)平衡、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)等生命活動中也具有至關(guān)重要的作用〔13〕。ROS是線粒體氧酸磷酸化過程的副產(chǎn)物，在正常生理?xiàng)l件下，ROS的產(chǎn)生和清除處于低水平動態(tài)平衡狀態(tài)，并因其高反應(yīng)活性參與調(diào)控細(xì)胞多種生理活動〔14〕。當(dāng)腦缺血發(fā)生后，腦血管血液供應(yīng)中斷使得氧氣和葡萄糖向腦組織輸送減少，從而導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)異常，氧化磷酸化出現(xiàn)障礙。再灌注期間，氧氣重新輸入引發(fā)的氧化應(yīng)激反應(yīng)是引起再灌注損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，線粒體在其中具有至關(guān)重要的作用〔15〕。腦缺血再灌注發(fā)生后，包括低氧、鈣超載在內(nèi)的多種病理因素導(dǎo)致線粒體氧化磷酸化發(fā)生異常，ROS呈現(xiàn)爆發(fā)式增長，氧化還原系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)失衡，線粒體內(nèi)ROS大量蓄積誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)一步加重線粒體損傷〔16〕。MDA是線粒體膜脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，其含量變化與脂質(zhì)過氧化過程相對應(yīng)，因此測定MDA含量可以用作反映線粒體氧化應(yīng)激水平的指標(biāo)〔17〕。線粒體是細(xì)胞中維持Ca2+動態(tài)平衡的重要細(xì)胞器〔18〕。缺血再灌注發(fā)生后氧化磷酸化反應(yīng)障礙，Ca2+通過多種機(jī)制進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，線粒體通過鈣單向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白吸收胞質(zhì)內(nèi)過多的Ca2+導(dǎo)致線粒體內(nèi)Ca2+超載〔19〕。線粒體鈣超載可導(dǎo)致線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔異常開放，線粒體內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白釋放到胞質(zhì)中，介導(dǎo)激活線粒體凋亡通路，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡〔20〕。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示葒草苷可降低MCAO大鼠的神經(jīng)功能評分和腦梗死體積，減輕大鼠腦組織損傷，這與王曉茹等〔12〕研究結(jié)果相吻合。此外本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)葒草苷可減輕線粒體氧化應(yīng)激對線粒體損傷，抑制線粒體鈣超載現(xiàn)象，改善大鼠腦損傷后的線粒體功能，這提示葒草苷對腦缺血再灌注大鼠腦保護(hù)作用與抑制線粒體氧化應(yīng)激和鈣超載，改善線粒體功能有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)在原有葒草苷的基礎(chǔ)上額外給予自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素干預(yù)后，葒草苷對腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用減弱，而且相關(guān)指標(biāo)結(jié)果也顯示，葒草苷對線粒體功能保護(hù)作用也遭到破壞，提示葒草苷對線粒體的保護(hù)作用可能有線粒體自噬的參與。

自噬相關(guān)蛋白(Atg)8家族蛋白成員與磷脂酰乙醇胺(PE)的結(jié)合是自噬體形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，LC3是Atg8蛋白家族的重要組成成員〔21〕。自噬發(fā)生時(shí)，LC3-Ⅰ與PE耦聯(lián)形成LC3-Ⅱ，后者參與自噬體膜的延伸〔22〕。LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)化為LC3-Ⅱ被認(rèn)為是自噬激活的標(biāo)志，常用LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值反映自噬發(fā)生水平。BNIP3是存在于線粒體外膜上的蛋白，作為缺氧誘導(dǎo)因子1α的靶標(biāo)，在缺血缺氧的情況下高表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)BNIP3表達(dá)上調(diào)可以介導(dǎo)線粒體自噬激活，其包含的LIR結(jié)構(gòu)域可與LC3結(jié)合，誘導(dǎo)線粒體自噬發(fā)生，清除腦缺血再灌注后受損的線粒體〔23～25〕。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)葒草苷可通過抑制自噬過度激活來減輕大鼠腦組織損傷〔12〕。雷帕霉素是一種常用的自噬誘導(dǎo)劑，通過抑制雷帕霉素靶蛋白mTOR活性誘導(dǎo)自噬發(fā)生，可與藥物聯(lián)用驗(yàn)證藥物對自噬的作用〔26〕。研究結(jié)果顯示，腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織線粒體中BNIP3和LC3的相對表達(dá)顯著增加，這與杜肖〔27〕的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。給予葒草苷治療后BNIP3和LC3蛋白相對表達(dá)均顯著降低，而在葒草苷的基礎(chǔ)上額外給予雷帕霉素時(shí)，葒草苷對LC3和BNIP3蛋白表達(dá)的影響被逆轉(zhuǎn)，進(jìn)一步說明葒草苷可抑制線粒體自噬。Wu等〔28〕研究發(fā)現(xiàn)電針預(yù)處理可明顯降低大鼠腦組織中LC3-Ⅱ和Beclin-1的表達(dá)相對下降，降低腦梗死體積和含水量，而自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素逆轉(zhuǎn)了電針預(yù)處理對LC3-Ⅱ和Beclin-1的表達(dá)降低及神經(jīng)保護(hù)作用，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其一致。

綜上所述，葒草苷可通過降低線粒體自噬過度表達(dá)來抑制線粒體氧化應(yīng)激和鈣超載，改善腦缺血再灌注大鼠線粒體功能損傷從而發(fā)揮腦保護(hù)作用。