陳亞瓊 高鵬 沈慧

(青海紅十字醫(yī)院口腔科，青海 西寧 810000)

牙周炎是常見(jiàn)的一種口腔疾病，炎癥、氧化應(yīng)激等均與牙周炎形成密切相關(guān)，人牙齦成纖維細(xì)胞(HGFs)是牙周膜與牙齦的主要細(xì)胞，可作為牙周支持組織的組成部分，并可誘導(dǎo)牙周組織再生，研究表明阿司匹林、積雪草酸等均可抑制HGFs細(xì)胞炎癥反應(yīng)〔1～3〕。黃芪甲苷屬于豆科草本植物黃芪的主要活性成分，其具有抗炎的作用，并可促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，研究表明黃芪甲苷可抑制NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白(NLRP)3炎癥小體的活化而抑制人牙周膜細(xì)胞的炎癥反應(yīng)〔4〕。但黃芪甲苷對(duì)HGFs損傷的作用尚未闡明。miR-126在高糖誘導(dǎo)的HGFs中表達(dá)下調(diào)，并可靶向TNF受體關(guān)聯(lián)因子(TRAF)6而抑制HGFs細(xì)胞中炎性因子的分泌〔5〕。核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB信號(hào)通路被激活后可促進(jìn)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的HGFs細(xì)胞炎癥反應(yīng)〔6〕。但黃芪甲苷是否可調(diào)控miR-126/NF-κB信號(hào)通路而參與牙周炎發(fā)生過(guò)程尚未可知。本文擬研究黃芪甲苷通過(guò)miR-126/NF-κB信號(hào)通路調(diào)控HGFs增殖及凋亡的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 黃芪甲苷購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司(純度≥98%)；NF-κB抑制劑PDTC購(gòu)自美國(guó)Abcam；HGFs購(gòu)自美國(guó)ATCC公司；Lipofectamine2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen；Trizol試劑購(gòu)自北京全式金生物；反轉(zhuǎn)錄與熒光定量檢測(cè)試劑購(gòu)自北京天根生化；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)試劑、凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma；兔抗人周期素(Cyclin)D1、Cleaved-半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3抗體購(gòu)自美國(guó)CST；兔抗人p-p65、磷酸化抑制蛋白κBα(p-IкBα)抗體購(gòu)自北京百奧萊博；二抗購(gòu)自武漢艾美捷科技有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)分組 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HGFs(2.5×105個(gè)/ml)接種于96孔板(100 μl/孔)，分別加入含有不同濃度(10、20、40 μg/ml)的黃芪甲苷培養(yǎng)液處理24 h〔7〕，分別記為10、20、40 μg/ml黃芪甲苷組。同時(shí)將正常培養(yǎng)的HGFs記為NC組。分別將miR-NC、miR-126 mimics、anti-miR-NC、anti-miR-126轉(zhuǎn)染入HGFs中，分別記為miR-NC組、miR-126組、anti-miR-NC組、anti-miR-126組。anti-miR-NC、anti-miR-126分別轉(zhuǎn)染入HGFs后加入含有濃度為40 μg/ml黃芪甲苷的培養(yǎng)液處理24 h，分別記為40 μg/ml黃芪甲苷+anti-miR-NC組、40 μg/ml黃芪甲苷+anti-miR-126組。anti-miR-126轉(zhuǎn)染入HGFs后加入NF-κB抑制劑PDTC 20 μmol/L〔8〕與40 μg/ml黃芪甲苷共同處理24 h，記為PDTC+40 μg黃芪甲苷+anti-miR-126組。

1.3MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 收集各組HGFs(2.5×105個(gè)/ml)接種于96孔板(100 μl/孔)，按照MTT試劑盒說(shuō)明書(shū)操作并檢測(cè)各孔吸光度值(A值)。

1.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 收集各組HGFs加入預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后棄上清，按照凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.5實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)細(xì)胞中miR-126的表達(dá)水平 采用Trizol法提取各組HGFs細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。按照qRT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)操作并檢測(cè)miR-126相對(duì)表達(dá)量。

1.6Western印跡檢測(cè)CyclinD1、Cleaved-Caspase-3、p-p65、p-IкBα蛋白表達(dá) 提取各組HGFs蛋白，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，轉(zhuǎn)膜、封閉2 h，分別加入一抗稀釋液(1∶1 000)與二抗稀釋液(1∶2 000)，滴加電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影后應(yīng)用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1不同濃度黃芪甲苷對(duì)HGFs增殖、凋亡及miR-126表達(dá)的影響 與NC組比較，10、20、40 μg/ml黃芪甲苷組細(xì)胞活力、CyclinD1蛋白水平及miR-126表達(dá)水平升高，凋亡率及Cleaved-Caspase-3蛋白水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見(jiàn)表1、圖1、圖2。

2.2miR-126對(duì)HGFs增殖、凋亡的影響 與miR-NC組比較，miR-126組miR-126、CyclinD1蛋白及細(xì)胞活力升高，Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)及細(xì)胞凋亡率下降，與anti-miR-NC組比較，anti-miR-126組miR-126、CyclinD1蛋白及細(xì)胞活力下降，Cleaved-Caspase-3蛋白及細(xì)胞凋亡率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見(jiàn)圖3、表2。

表1 不同濃度黃芪甲苷對(duì)HGFs增殖、凋亡及miR-126表達(dá)的影響

圖1 不同濃度黃芪甲苷對(duì)HGFs凋亡的影響

1～4:NC組,10 μg/ml黃芪甲苷組，20 μg/ml黃芪甲苷組，40 μg/ml黃芪甲苷組圖2 各組CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)

1～4：miR-NC組,miR-126組,anti-miR-NC組,anti-miR-126組圖3 Western印跡檢測(cè)各組CyclinD1、 Cleaved-Caspase-3蛋白的表達(dá)

表2 miR-126對(duì)HGFs增殖、凋亡的影響

2.3anti-miR-126減弱黃芪甲苷對(duì)HGFs增殖、凋亡的影響 與40 μg/ml黃芪甲苷+anti-miR-NC組比較，40 μg/ml黃芪甲苷+anti-miR-126組miR-126、CyclinD1蛋白及細(xì)胞活力下降，Cleaved-Caspase-3及細(xì)胞凋亡率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見(jiàn)表3、圖4。

表3 anti-miR-126減弱黃芪甲苷對(duì)HGFs增殖、凋亡的影響

2.4HGFs中NF-κB信號(hào)通路蛋白的表達(dá) 與NC組比較，40 μg/ml黃芪甲苷組p-p65、p-IкBα蛋白水平降低(均P<0.05)，anti-miR-126組p-p65、p-IкBα蛋白水平升高(均P<0.05)；與40 μg/ml黃芪甲苷+anti-miR-NC組比較，40 μg/ml黃芪甲苷+anti-miR-126組p-p65、p-IкBα蛋白水平升高(均P<0.05)，見(jiàn)圖5、表4。

1～2：40 μg/ml黃芪甲苷+anti-miR-NC組,40 μg/ml黃芪甲苷+anti-miR-126組圖4 Western印跡檢測(cè)CyclinD1、 Cleaved-Caspase-3蛋白的表達(dá)

1～5：NC組,40 μg/ml黃芪甲苷組，anti-miR-126組,40 μg/ml黃芪甲苷+anti-miR-NC組,40 μg/ml黃芪甲苷+anti-miR-126組圖5 Western印跡檢測(cè)p-p65、p-IкBα蛋白的表達(dá)

表4 HGFs中NF-κB信號(hào)通路蛋白的表達(dá)

2.5NF-κB抑制劑PDTC逆轉(zhuǎn)anti-miR-126對(duì)黃芪甲苷對(duì)HGFs增殖、凋亡的影響作用 與40 μg/ml黃芪甲苷+anti-miR-126組比較，PDTC+40 μg/ml黃芪甲苷+anti-miR-126組細(xì)胞活力與CyclinD1蛋白水平升高(均P<0.05)，凋亡率、Cleaved-Caspase-3、p-p65/p-IκBα蛋白水平降低(均P<0.05)，見(jiàn)圖6、表5。

1，2：40 μg/ml黃芪甲苷+anti-miR-126組,PDTC+40 μg/ml黃芪甲苷+anti-miR-126組圖6 Western印跡檢測(cè)p-p65、p-IкBα、 CyclinD1、Cleaved-Caspase-3蛋白的表達(dá)

表5 NF-κB抑制劑PDTC逆轉(zhuǎn)anti-miR-126對(duì)黃芪甲苷對(duì)HGFs增殖、 凋亡的影響作用

3 討 論

牙周炎是一種牙周支持組織慢性炎癥性疾病，其主要是由于菌斑微生物感染引起的一種疾病，牙周局部組織中可激活炎癥反應(yīng)從而破壞牙槽骨，既往研究顯示，藜蘆酸抑制HGFs細(xì)胞中LPS誘導(dǎo)的白細(xì)胞介素(IL)-6和IL-8產(chǎn)生〔9〕。槲皮素通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路抑制HGFs中LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)〔10〕。冬凌草甲素通過(guò)激活過(guò)氧化物酶增殖物激活受體(PPAR)γ抑制LPS誘導(dǎo)的HGFs炎癥反應(yīng)〔11〕。

黃芪甲苷具有抗炎、抗氧化、降血糖等作用，并可保護(hù)糖尿病腎臟，研究表明黃芪甲苷可抑制高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡〔12〕。黃芪甲苷可能通過(guò)抑制Capase-3表達(dá)而抑制細(xì)胞凋亡從而減輕大鼠肝星狀細(xì)胞氧化損傷〔13〕。本研究結(jié)果顯示，黃芪甲苷可明顯增強(qiáng)HGFs活力，并可促進(jìn)HGFs的增殖及CyclinD1的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，黃芪甲苷可降低HGFs凋亡率，并可抑制Cleaved-Caspase-3的表達(dá)，提示黃芪甲苷可抑制HGFs凋亡。

本研究提示黃芪甲苷可能通過(guò)上調(diào)miR-126的表達(dá)從而發(fā)揮作用。miR-126表達(dá)上調(diào)可減輕LPS誘導(dǎo)的胰腺炎癥損傷〔14〕。芒果多酚可抑制miR-126/磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/哺乳動(dòng)物雷帕霉素蛋白(mTOR)軸而減輕結(jié)腸炎的炎癥〔15〕。本研究結(jié)果顯示，miR-126過(guò)表達(dá)可明顯提高HGFs活力，而降低細(xì)胞凋亡率，抑制miR-126表達(dá)可降低HGFs活力，而提高細(xì)胞凋亡率。本研究結(jié)果顯示，抑制miR-126表達(dá)與黃芪甲苷聯(lián)合處理后，HGFs活力降低，而凋亡率升高。miR-424過(guò)表達(dá)可靶向堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)2而抑制NF-κB途徑從而抑制LPS誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡和炎癥〔16〕。牙周組織處于炎癥狀態(tài)時(shí)，NF-κB-p65核內(nèi)轉(zhuǎn)后與下游靶基因結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)IL-6等炎性細(xì)胞因子表達(dá)〔17〕。姜黃素可通過(guò)髓系細(xì)胞觸發(fā)受體(TREM)2/Toll樣受體(TLR)4/NF-κB途徑促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞M2極化，從而抑制LPS誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)〔18〕。本研究結(jié)果顯示，黃芪甲苷可降低HGFs中p-p65、p-IкBα蛋白水平，抑制miR-126表達(dá)可提高HGFs中p-p65、p-IкBα蛋白水平，而黃芪甲苷與抑制miR-126表達(dá)聯(lián)合作用后HGFs中p-p65、p-IкBα蛋白水平升高，提示黃芪甲苷可能通過(guò)調(diào)控miR-126/NF-κB通路而發(fā)揮作用。同時(shí)本研究進(jìn)一步分析顯示，NF-κB抑制劑PDTC、黃芪甲苷與抑制miR-126表達(dá)聯(lián)合作用后，HGFs活力升高，而凋亡率降低，提示黃芪甲苷可通過(guò)miR-126/NF-κB信號(hào)通路而發(fā)揮作用。

綜上，黃芪甲苷可通過(guò)上調(diào)miR-126的表達(dá)而抑制NF-κB信號(hào)通路的活化從而促進(jìn)HGFs增殖及抑制細(xì)胞凋亡，miR-126可能作為黃芪甲苷治療牙周炎的潛在靶點(diǎn)，還可為進(jìn)一步揭示黃芪甲苷治療牙周炎的分子機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。