池魁 袁濤 孫歡歡 李燁 張金文

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院 1血管外科，河北 石家莊 050000；2麻醉科)

頸動(dòng)脈可以將心臟部位的血液輸送到人體的大腦、頭部、面部中〔1,2〕。當(dāng)血液中出現(xiàn)沉積物時(shí)，就會(huì)造成某一個(gè)部位的血管變窄，血管壁會(huì)隨著病情的嚴(yán)重程度越來越窄，當(dāng)達(dá)到完全阻塞血流時(shí)，就會(huì)誘發(fā)腦卒中疾病〔3〕。血管平滑肌細(xì)胞是構(gòu)成平滑肌的一種組織，是較橫紋肌原始的一種肌肉，主要分布在人體內(nèi)臟器官內(nèi)，是可以單獨(dú)存在的，但是大部分的平滑肌細(xì)胞都是成層或者成束分布的。其中平滑肌的細(xì)胞骨架系統(tǒng)是比較發(fā)達(dá)的，主要是由中間絲、密體、密斑組成。細(xì)胞周邊部的肌漿中，含有粗細(xì)兩種肌絲。研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)脈粥樣硬化、冠脈旁路移植術(shù)等的特征均為血管平滑肌細(xì)胞增生及異常遷移〔4〕。目前臨床缺乏有效治療頸動(dòng)脈狹窄的方法，因此發(fā)現(xiàn)有效診治頸動(dòng)脈狹窄具有重要的意義。本研究主要探討沉默miR-146a對(duì)頸動(dòng)脈狹窄模型大鼠血管平滑肌細(xì)胞活性的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 研究動(dòng)物：48只SPF級(jí)SD大鼠，購自商丘美蘭生物工程有限公司〔動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(豫)2022-0006〕，4～6月齡，平均(4.75±0.95)月齡，體重230～320 g，平均(261.25±42.75)g，光照12 h/d，在濕度25%～36%、溫度為25～27℃的溫度中喂養(yǎng)大鼠1 w。本研究經(jīng)河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過。

主要試劑：miR-146a(武漢博歐特生物科技有限公司)；流式細(xì)胞儀購自(上海然哲儀器設(shè)備有限公司)；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)試劑(艾美捷科技有限公司)；L型鈣通道蛋白(CaV1.2)抗體(武漢益普生物科技有限公司，貨號(hào)：ATA25947)；CaV1.3抗體(上海恪敏生物科技有限公司，貨號(hào)：bs-3932R)；Toll樣受體(TLR)4抗體(武漢菲恩生物科技有限公司，貨號(hào)：FNab09837)；髓樣分化因子(MyD88)抗體(蘇州阿爾法生物實(shí)驗(yàn)器材有限公司，貨號(hào)：BD-PT2928)；核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB抗體(上海西格生物科技有限公司，貨號(hào)：XG-K97299)。

1.2方法

1.2.1慢病毒載體構(gòu)建 miR-146a表達(dá)下調(diào)的慢病毒載體構(gòu)建、大鼠miR-146a序列查找及設(shè)計(jì)由上海GeneChem公司完成，重組miR-146a上調(diào)病毒載體(Lentiviral-mediated-Rbfox1)、miR-146a下調(diào)載體(Lentiviral-mediated-Rbfox1-RNAi)由上海GeneChem公司合成，并經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，病毒滴度為108 TU/ml，制備完成將重組慢病毒載體在-80℃保存。

1.2.2分組及建模 大鼠平均分為4組，其中3組參照鄭文婧等〔5〕的方法造模:36只大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉，沿頸部正中間切開，將右頸總動(dòng)脈分離固定在5 ml注射器針頭上，采用尼龍線將頸總動(dòng)脈扎緊，然后將針頭抽出，在血流恢復(fù)以后將肌肉、皮膚縫合，大鼠喂養(yǎng)6 w后，經(jīng)血管超聲檢查，手術(shù)側(cè)右頸總動(dòng)脈舒張末血流速度60～100 cm/s、峰值血流速度155～170 cm/s說明造模成功。造模成功的3組為模型組、過表達(dá)組及沉默組，剩余1組為空白組不做特殊處理。

1.2.3慢病毒轉(zhuǎn)染 在建模成功后過表達(dá)組、沉默組大鼠右側(cè)頸動(dòng)脈注射分別含10 μl Lentiviral-mediated-Rbfox1、Lentiviral-mediated-Rbfox1-RNAi的 miR-146a mimic慢病毒懸液。空白組、模型組大鼠注射等量生理鹽水。1 w后觀察變化。

1.2.4miR-146a基因表達(dá)量 采集所有大鼠心室血液，2 000 r/min 4℃離心10 min,收集血清。miRNA采用mirVana PARIS試劑盒提取純化。在室溫下加入取出的500 μl血清樣品等體積變性液,混合均勻，加入同樣多的體積酸性酚氯仿,搖晃30～60 s；離心5 min，14 000 r/min在室溫下操作。把上清液放到另一個(gè)管中，加入1.25倍無水乙醇充分混勻，然后加入柱中，離心30 s，12 000 r/min,棄濾液；700 μl加入柱中，清洗1次,12 000 r/min離心30 s，棄濾液；把500 μl加入柱中，清洗2次,12 000 r/min離心1 min；95℃預(yù)熱洗脫液60 μl加入柱子中，離心1 min 12 000 r/min,收集miRNA。miR-146a上游引物:5′-GGGTGAGAACTGAATTCCA-3′,下游:5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′。U6上游引物:5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAA-3′,下游:5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)提取DNA 0.5 ml血清加等量的裂解液于尖底離心管中，37℃孵育1 h，加入0.1 ml樣品稀釋液。PCR擴(kuò)增取上述0.02 ml DNA提取液加入分裝好的反應(yīng)液管中。

1.2.5病理組織學(xué)觀察 各組大鼠右側(cè)頸動(dòng)脈注射3.0% 80 mg/kg的戊巴比妥麻醉，迅速取分離鼠右側(cè)頸動(dòng)脈組織，然后將右側(cè)頸動(dòng)脈組織制作成標(biāo)本，用4%多聚甲醛固定，室溫下用15%乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣、脫水后用石蠟進(jìn)行包埋，作3 μm的切片，最后蘇木素-伊紅(HE)染色處理，采用光學(xué)顯微鏡觀察大鼠右側(cè)頸動(dòng)脈病理變化。

1.2.6N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDA)、同型半胱氨酸(Hcy)水平檢測(cè) 采用流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)NMDA、Hcy，進(jìn)行離心處理(轉(zhuǎn)速為3 000 r/min,離心5 min)，棄上清，加入100 μl FACS緩沖液，再加入Fc受體抗體0.5 mg/ml，細(xì)胞浸泡3 min。加入熒光抗體1 μl(0.5 mg/ml)，水浴30 min。加入350 μl FACS緩沖液,3 000 r/min，輕輕混勻，離心5 min,棄上清，重復(fù)2次，洗細(xì)胞去除游離的熒光抗體。取100 μl儀器緩沖液加入去除有利細(xì)胞的熒光抗體沉淀細(xì)胞后，將懸浮細(xì)胞移入FACS專用管中進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.2.7血管平滑肌細(xì)胞的分離培養(yǎng) 將大鼠處死，分離，取雙側(cè)骼動(dòng)脈分權(quán)以上2 cm處動(dòng)脈,刮取血管中膜，然后將血管中膜放置培養(yǎng)皿，剪碎，然后放入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，5 d換1次液,然后進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.8血管平滑肌細(xì)胞增殖水平 采用MTT比色法檢測(cè)，將血管平滑肌細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液,然后接種4×103個(gè)細(xì)胞在96孔板中，將20 μl MTT試劑加入后，培養(yǎng)4 h，棄上清，加入150 μl二甲亞礬，搖晃10 min，490 nm波長處的各孔光密度值使用酶標(biāo)儀查看。

1.2.9血管平滑肌細(xì)胞遷移能力檢測(cè) 采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組血管平滑肌細(xì)胞遷移能力，將細(xì)胞接種于18孔板中，細(xì)胞增長至90%左右時(shí)，采用100 μl槍頭垂直劃3條直線，使用磷酸鹽緩沖液(PBS)反復(fù)清洗3次，每次清洗3 min，加入0.5%血清培養(yǎng)基并觀察24 h，使用倒置顯微鏡觀察各組血管平滑肌細(xì)胞遷移能力。

1.2.10CaV1.2、CaV1.3、TLR4、MyD88、NF-κB蛋白 采用Western印跡法檢測(cè)，取大鼠牙髓組織蛋白。煮沸5 min使蛋白變性后用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后依據(jù)蛋白分子大小把凝膠切開并轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用Western封閉液把CaV1.2、CaV1.3、TLR4、MyD88、NF-κB和內(nèi)參U6蛋白封閉90 min在室內(nèi),按1∶1 000加到CaV1.2抗體、CaV1.3抗體、TLR4抗體、MyD88抗體、NF-κB抗體，以1∶2 000加入c-fos抗體,孵育過夜4℃，每隔10 min使用洗滌液清洗1次，共5次。按1∶5 000加入稀釋山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G,孵育60 min室溫水平搖勻,每隔10 min使用洗滌液清洗1次，共5次。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，定量分析蛋白表達(dá)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行F檢驗(yàn)、獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組miR-146a基因表達(dá)量比較 如表1所示，相比于空白組，模型組、過表達(dá)組、沉默組miR-146a基因表達(dá)量顯著較高(P<0.05)；相比于模型組，過表達(dá)組miR-146a基因表達(dá)量顯著較高(P<0.05)；沉默組miR-146a基因表達(dá)量顯著較低(P<0.05)；相比于過表達(dá)組，沉默組miR-146a基因表達(dá)量顯著較低(P<0.05)。

2.2各組右側(cè)頸動(dòng)脈組織病理組織學(xué)觀察 如圖1所示，空白組內(nèi)膜光滑，無增厚現(xiàn)象的出現(xiàn)；模型組血管內(nèi)膜明顯增厚，管腔內(nèi)已出現(xiàn)狹窄現(xiàn)象；過表達(dá)組血管內(nèi)膜增厚現(xiàn)象嚴(yán)重，管腔血管嚴(yán)重狹窄現(xiàn)象嚴(yán)重，黏膜層增生；沉默組內(nèi)膜明顯光滑，且?guī)缀鯚o增厚現(xiàn)象。

2.3各組血管平滑肌細(xì)胞活中CaV1.2、CaV1.3、NMDA、Hcy表達(dá)情況 如表1所示，相比于空白組，模型組、過表達(dá)組、沉默組CaV1.2、CaV1.3、NMDA、Hcy表達(dá)顯著更低(P<0.05)；相比于模型組，過表達(dá)組CaV1.2、CaV1.3、NMDA、Hcy表達(dá)顯著更低，沉默組CaV1.2、CaV1.3、NMDA、Hcy表達(dá)顯著較高(P<0.05)；相比于過表達(dá)組，沉默組CaV1.2、CaV1.3、NMDA、Hcy表達(dá)顯著較高(P<0.05)。

表1 各組血管平滑肌細(xì)胞活中CaV1.2、CaV1.3、NMDA、Hcy表達(dá)對(duì)比

圖1 各組右側(cè)頸動(dòng)脈組織病理觀察(HE染色，×400)

2.4各組血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移情況比較 如表2所示，相比于空白組，模型組、過表達(dá)組、沉默組增殖顯著較高，遷移顯著較低(P<0.05)；相比于模型組，過表達(dá)組增殖顯著較高，遷移顯著較低；沉默組增殖較低，遷移較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；相比于過表達(dá)組，沉默組增殖較低，遷移較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 各組血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移情況比較

2.5各組右側(cè)頸動(dòng)脈組織TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路蛋白表達(dá)量比較 如表3、圖2所示，模型組、過表達(dá)組、沉默組TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路蛋白表達(dá)量明顯高于空白組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；過表達(dá)組TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路蛋白表達(dá)量明顯高于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；沉默組TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路蛋白表達(dá)量明顯低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；沉默組TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路蛋白表達(dá)量明顯低于過表達(dá)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表3 各組右側(cè)頸動(dòng)脈組織TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào) 通路蛋白表達(dá)量比較

1～4：空白組，模型組，過表達(dá)組，沉默組圖2 各組細(xì)胞TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路 蛋白表達(dá)

3 討 論

腦卒中目前是死亡率及致殘率最高的疾病之一〔6〕。頸動(dòng)脈狹窄可以分為有癥狀性狹窄和無癥狀狹窄，頸動(dòng)脈狹窄的并發(fā)癥主要是和大腦供血減少、斑塊破裂、血液阻滯相關(guān)，大腦出現(xiàn)缺氧缺血時(shí)就會(huì)發(fā)生眩暈、頭暈、短暫性失眠及頭暈的癥狀〔7〕。當(dāng)斑塊破裂之后小血塊就會(huì)隨著血流入到大腦中，從而阻塞小動(dòng)脈血管。血管平滑肌細(xì)胞主要分布在人體內(nèi)臟器官內(nèi)，平滑肌由中間絲、密體、密斑組成,是構(gòu)成血管中膜的物質(zhì)，有著很強(qiáng)的生理功能，可以調(diào)節(jié)血管的舒張性并維持血管壁的完整性〔8，9〕。平滑肌雖然有類似于肌絲的結(jié)構(gòu)，但是不會(huì)像骨骼肌一樣有序的排列。平滑肌細(xì)胞中的細(xì)肌絲有同骨骼肌類似的分子結(jié)構(gòu)，橫橋的激活開始于它的磷酸化〔10，11〕。平滑肌大都具有自律性，在遇到牽拉時(shí)可作為一個(gè)整體起反應(yīng)〔12〕。血管平滑肌細(xì)胞可參與動(dòng)脈狹窄的疾病進(jìn)展，增強(qiáng)血管平滑肌的細(xì)胞活性可以調(diào)節(jié)血管的舒張性并維持血管壁的完整性，減少張力，進(jìn)而造成組織器官出現(xiàn)變形。

miRNA是一類由內(nèi)源基因編碼的單鏈RNA分子，可以在動(dòng)植物中參與轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，存在形式是基因簇、多拷貝、單拷貝，同時(shí)也是一類長度為20～24個(gè)核苷酸及內(nèi)生的小RNA〔13〕。miRNA 與其靶基因的進(jìn)化有著密切的聯(lián)系，有助于進(jìn)一步了解作用及機(jī)制，miRNA還存在于多種機(jī)制，miRNA與靶基因完全互補(bǔ)結(jié)合后功能、方式非常的相似〔14，15〕。作用時(shí)與靶基因不完全互補(bǔ)結(jié)合，大鼠體內(nèi)沉默miR-146a時(shí)，大鼠體內(nèi)的蛋白及基因等都有著變化，可以提高大鼠血管平滑肌細(xì)胞活性〔16〕，提示miR-146a的表達(dá)水平與頸動(dòng)脈狹窄可能相關(guān)，miR-146a水平的上升提示著頸動(dòng)脈狹窄的發(fā)生，在血管平滑肌細(xì)胞活性增加時(shí)，就會(huì)降低miR-146a水平，從而減少頸動(dòng)脈狹窄所導(dǎo)致的身體損傷。

血管平滑肌細(xì)胞活中的CaV1.2、CaV1.3、NMDA、Hcy都可以參與疾病的進(jìn)展〔17〕。其中Hcy受體可以誘導(dǎo)平滑肌的細(xì)胞遷移和增殖，NMDA受體介導(dǎo)了Hcy誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞的遷移和增殖，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)作為Hcy結(jié)合受體已被廣泛的研究，Hcy可以活化神經(jīng)嵴來源的平滑肌細(xì)胞〔18，19〕。通過RNA干擾技術(shù)沉默大鼠的平滑肌細(xì)胞，能夠特異性抑制大鼠血管平滑肌細(xì)胞CaV1.2、CaV1.3基因。

TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路，TLR4是位于九號(hào)染色體的基因，在病原體識(shí)別及先天免疫激活中起到很重要的基礎(chǔ)性作用，同時(shí)也是具有結(jié)構(gòu)及功能上的優(yōu)勢(shì)，可以很快識(shí)別傳染源上表達(dá)的病原體相關(guān)分子的模式，同時(shí)還可作為介導(dǎo)機(jī)體免疫力的一種重要細(xì)胞因子〔20〕。MyD88處于三號(hào)染色體的基因，在適應(yīng)性免疫應(yīng)答及先天性中有著重要的關(guān)鍵性作用，有著重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，可以調(diào)節(jié)促炎基因的激活。NF-κB是一種蛋白質(zhì)復(fù)合物，可以控制轉(zhuǎn)錄的DNA，還可以促使細(xì)胞存活及細(xì)胞因子產(chǎn)生，在所有的動(dòng)物模型中可以參與細(xì)胞的刺激反應(yīng)，NF-κB也與記憶過程、突觸可塑性有關(guān)〔21〕。以上論述說明了抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，可以很好地抑制頸動(dòng)脈狹窄大鼠的炎癥反應(yīng)，從而很好的保護(hù)頸動(dòng)脈出現(xiàn)狹窄的發(fā)生。

綜上所述，沉默miR-146a對(duì)頸動(dòng)脈狹窄模型大鼠血管平滑肌細(xì)胞活性有著干預(yù)的作用，其作用機(jī)制可能與TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)。