李婷 程亞楠 周小平

(寧夏醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，寧夏 銀川 750004)

人體皮膚從30歲左右開始進(jìn)入衰退階段。隨著人們對(duì)皮膚衰老的深入認(rèn)識(shí)與不斷探索發(fā)現(xiàn)，自然衰老皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞增殖減少，脂質(zhì)和膠原合成減少〔1〕，表皮穩(wěn)態(tài)失衡。穩(wěn)態(tài)是組織器官更新時(shí)維持恒定數(shù)量細(xì)胞的生理過(guò)程〔2〕。皮膚穩(wěn)態(tài)由位于皮膚組織中干細(xì)胞的自我更新和分化維持〔3，4〕。表皮干細(xì)胞負(fù)責(zé)維持和生成成熟的表皮及其附屬器官。表皮干細(xì)胞位于皮膚不同的“龕室”，有著驚人的增殖能力。通常情況下，表皮干細(xì)胞不斷增殖、分化，以替換因正常分化和組織更新或損傷引起細(xì)胞死亡而損失的角質(zhì)形成細(xì)胞，維持表皮穩(wěn)態(tài)。眾多以人或動(dòng)物為模型的研究表明，衰老表皮增殖能力下降，包括在基礎(chǔ)刺激方面和響應(yīng)增殖刺激方面，這些結(jié)果最終指向?qū)S護(hù)表皮穩(wěn)態(tài)負(fù)責(zé)任的表皮干細(xì)胞，說(shuō)明其涉及衰老過(guò)程〔5〕。本研究探討，γ分泌酶抑制劑(DAPT)阻斷跨膜受體蛋白(Notch)信號(hào)通路后補(bǔ)益營(yíng)衛(wèi)方對(duì)衰老皮膚表皮干細(xì)胞Notch信號(hào)通路Notch1、Notch配體蛋白(Jagged)1、重組信號(hào)結(jié)合蛋白(RBP)-Jκ和毛發(fā)分裂增強(qiáng)因子(Hes)1基因及蛋白表達(dá)水平的影響，探討補(bǔ)益營(yíng)衛(wèi)方延緩皮膚衰老的機(jī)制。

1 材料與儀器

1.1實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)藥物：補(bǔ)益營(yíng)衛(wèi)方由生黃芪15 g、炙甘草7 g、人參5 g組成，購(gòu)買于寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬回醫(yī)中醫(yī)醫(yī)院門診部，用水煮法制備藥物，終濃度為0.5 g生藥/ml，放置于4℃冰箱冷藏備用。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)SAMP8雄性小鼠，8月齡10只(老年組)；SPF級(jí)SAMR1雄性小鼠，3月齡10只(年輕組)，均購(gòu)于北京至善健康醫(yī)學(xué)研究院有限公司，生產(chǎn)單位：北京華阜康生物科技股份有限公司，質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK(京)2014-0004。飼養(yǎng)于寧夏醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。主要試劑：0.25%胰蛋白酶(Gibco公司，批號(hào)25200-072)，DAPT(MCE公司，批號(hào)HY-13027)，角質(zhì)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基(iCell公司，批號(hào)iCell-0019)，DispaseⅡ的DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Sigma-Aldrich公司，批號(hào)D4693)，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)引物(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)，SYBR Permix Ex TaqTM Ⅱ熒光定量試劑盒(TaKaRa公司，批號(hào)DRR081S)，ReverTra Ace-α-反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TOYOBO公司，批號(hào)FSK-100)，山羊抗兔IgG H&L(批號(hào)ab205718)、Anti-GAPDH抗體(批號(hào)ab37168)、Anti-activated Notch1抗體(批號(hào)ab8925)、Anti-Jagged1抗體(批號(hào)ab7771)、Anti-RBPJκ抗體-ChIP Grade(批號(hào)ab25949)、Anti-Hes1抗體(批號(hào)ab221788)(Abcam公司)。實(shí)驗(yàn)儀器：37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠，型號(hào)BC-J160S)，恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，型號(hào)DK-600S)、電熱恒溫震蕩水槽(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，型號(hào)DK-2B)，高級(jí)分析倒置顯微鏡(Nikon公司，型號(hào)DS-Ri2)，Rt-PCR儀(Thermo Fisher Scientific公司，型號(hào)Applied BiosystemsTMViiA 7 Real-Time PCR System)，高速離心機(jī)(Thermo Fisher公司，型號(hào)75004250)，超高速離心機(jī)(SCILOGEX公司，型號(hào)D3024R)，Mini.P-4型電泳槽(北京凱元信瑞儀器有限公司，型號(hào)MP-3030)。

1.2含藥血清制備 SPF級(jí)雄性SAMP8小鼠，8月齡10只，予以補(bǔ)益營(yíng)衛(wèi)方10 g/kg連續(xù)灌胃1 w，1次/d，第8天末次給藥1 h后，腹腔注射4%水合氯醛予以麻醉，無(wú)菌操作進(jìn)行心臟采血，將血液于室溫靜置2 h，3 000 r/min離心10 min，取出血清，超凈工作臺(tái)無(wú)菌過(guò)濾，56℃滅活30 min，放置-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｍ瑫r(shí)以DMEM培養(yǎng)基稀釋為含2.5%補(bǔ)益營(yíng)衛(wèi)方的含藥血清培養(yǎng)液。

1.3細(xì)胞分離、培養(yǎng)、傳代 頸椎脫臼處死兩組小鼠后，分別浸入75%乙醇消毒15 min，取小鼠背部整塊皮膚，用磷酸鹽緩沖液(PBS)浸洗3次后，將皮膚剪成大小為0.5 cm×0.5 cm，然后浸入含0.1%中性蛋白酶Dispase Ⅱ的DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，4℃消化過(guò)夜。用鑷子分離真皮與表皮，收集表皮，制備表皮細(xì)胞懸液，用80 μm濾網(wǎng)過(guò)篩后用離心機(jī)以1 000 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)上清液，然后加入2 ml表皮干細(xì)胞完全培養(yǎng)基(含0.2%角質(zhì)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基)，通過(guò)移液均勻制備成細(xì)胞，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，按4×104～5×104/cm2的密度將懸浮液接種在已包被基質(zhì)膠的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)細(xì)胞，每2～3 d換液，在更換液前后均在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況。當(dāng)細(xì)胞融合接近75%～85%時(shí)進(jìn)行傳代。其中將年輕組細(xì)胞分為A組(常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng))和B組(含5 μmol/L DAPT的完全培養(yǎng)基培養(yǎng))；老年組細(xì)胞分為3組，C組(常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng))、D組(含5 μmol/L DAPT的完全培養(yǎng)基培養(yǎng))、E組(含5 μmol/L DAPT+2.5%藥物血清濃度的完全培養(yǎng)基培養(yǎng))。48 h后收集細(xì)胞用熒光定量PCR法定量相應(yīng)指標(biāo)基因表達(dá)，用Western印跡檢測(cè)相應(yīng)指標(biāo)蛋白表達(dá)。

1.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)衰老小鼠表皮干細(xì)胞Notch通路被阻斷后的Notch1、Jagged1、RBP-Jκ和Hes1 mRNA表達(dá) 從GenBank下載Notch1(NM_008714.3)、Jagged1(NM_013822.5)、RBP-Jκ(NM_001080927.2)和Hes1(NM_006521797.2)mRNA序列，引物序列為：Notch1上游：5′-CAGCAAG-AAGAAGCGGAGAG-3′；下游:5′-GAGCACCATCTGAGGCATTC-3′。Jagged1上游:5′-TGGACGGAGACAA-CTGGTATC-3′；下游:5′-GGAAGACTGGCACTCATTGATG-3′。RBP-Jκ上游:5′-TTCTATGGCAACAGC-GATGAC-3′；下游:5′-GACCGAAGGCGATTGAACAG-3′。Hes1上游:5′-TCATGGAGAAGAGGCGAAGG-3′；下游:5′-CGGAGGTGCTTCACAGTCA-3′。以GAPDH為內(nèi)參基因，上游:5′-AGGTCGGTGTGAACGGATT-3′；下游:5′-TGAGTGGAGTCATACTGGAACA-3′。采用Trizol一步法分別提取上述各組總RNA。定量后取12 μl RNA溶液，ReverTra Ace逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA(具體操作參照說(shuō)明書)。采用Rt-PCR儀行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。具體操作如下：反應(yīng)體系：上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μl，模板cDNA 2 μl，ddH2O 6.4 μl，SYBR Permix Ex TaqTM Ⅱ(2×)10 μl。反應(yīng)條件：95℃、5 min，1個(gè)循環(huán)；95℃、15 s，60℃、30 s，40個(gè)循環(huán)。結(jié)果檢測(cè)：采用Bio-Rad CFX Manager(Ver3.0)軟件分析PCR過(guò)程，PCR擴(kuò)增過(guò)程中擴(kuò)增產(chǎn)物熒光信號(hào)超過(guò)基線值時(shí)的循環(huán)數(shù)即為樣本的Ct值。以GAPDH為內(nèi)參基因，軟件自動(dòng)得出△Ct、△△Ct及2-ΔΔCt值，由熔解曲線判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。

1.5Western印跡檢測(cè)衰老小鼠表皮干細(xì)胞Notch通路被阻斷后的Notch1、Jagged1、RBP-Jκ和Hes1蛋白表達(dá) 各組提取總蛋白后進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉后分別加入上述蛋白的一抗和內(nèi)參GAPDH，洗膜后加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗。然后加入電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑，化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)檢測(cè)，條帶掃描獲得灰度值，以目的基因灰度值/GAPDH灰度值作為目的基因蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS26.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1補(bǔ)益營(yíng)衛(wèi)方對(duì)衰老小鼠表皮干細(xì)胞Notch通路阻斷后的Notch1、Jagged1、RBP-Jκ和Hes1 mRNA和蛋白表達(dá)的影響 與A組相比，B組和C組Notch1、Jagged1、RBP-Jκ和Hes1 mRNA和蛋白水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與C組比較，D組和E組Notch1、Jagged1、RBP-Jκ和Hes1 mRNA和蛋白水平均明顯降低(P<0.05)；與D組比較，E組Notch1、Jagged1、RBP-Jκ和Hes1 mRNA和蛋白水平明顯降低(P<0.05)，見表1。提示DAPT阻斷Notch通路后，補(bǔ)益營(yíng)衛(wèi)方對(duì)衰老小鼠表皮干細(xì)胞Notch通路的Notch1、Jagged1、RBP-Jκ和Hes1 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量具有明顯的抑制作用。

表1 各組表皮干細(xì)胞Notch1、Jagged1、RBP-Jκ和Hes1 mRNA相對(duì)表達(dá)及蛋白表達(dá)比較

2.2補(bǔ)益營(yíng)衛(wèi)方對(duì)衰老小鼠表皮干細(xì)胞Notch通路阻斷后的Notch1、Jagged1、RBP-Jκ和Hes1蛋白表達(dá)的影響 B組Notch1、Jagged1、RBP-Jκ和Hes1條帶完全不顯示，說(shuō)明年輕組的4種蛋白被DAPT完全抑制表達(dá)；C組色帶均比A組深，說(shuō)明隨著年齡增大，4種蛋白表達(dá)量均增加；C組、D組、E組的4種蛋白色帶依次逐漸變淺，且Notch1、Jagged1、RBP-Jκ在E組色帶接近甚至比A組淺，Hes1在E組色帶甚至和A組一樣幾乎不顯示，說(shuō)明DAPT阻斷Notch通路后，補(bǔ)益營(yíng)衛(wèi)方可以抑制衰老小鼠表皮干細(xì)胞中Notch1、Jagged1、RBP-Jκ和Hes1蛋白的表達(dá)，見圖1。

圖1 Western印跡檢測(cè)各組Notch1、Hes1、Jagged1、 RBP-Jκ蛋白表達(dá)

3 討 論

皮膚組織具有較強(qiáng)的再生能力，其外層的表皮終身不斷自我更新，而表皮干細(xì)胞的無(wú)限增殖和分化，是表皮組織結(jié)構(gòu)更新的基礎(chǔ)。表皮干細(xì)胞在皮膚組織的自我更替及維護(hù)機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用〔6〕。當(dāng)皮膚衰老時(shí)，干細(xì)胞會(huì)發(fā)生功能的異常變化及異常的增殖、分化。表皮干細(xì)胞的增殖與分化不但為自身基因所預(yù)先設(shè)置，而且會(huì)受到干細(xì)胞“壁龕”的調(diào)控〔7〕。Notch家族參與調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖、黏附、遷移及血管生成，在胚胎發(fā)育及組織穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用〔8〕。Notch信號(hào)通路由Notch受體、Notch配體及細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)器分子CSL DNA結(jié)合蛋白(CBF-1/Suppresor of Hairless/LAG1的合稱)3部分組成〔9〕。在哺乳動(dòng)物中共發(fā)現(xiàn)4類Notch基因，分別為Notch1～4〔10〕。其中Notch1是高度保守的Ⅰ型跨膜糖蛋白，作為Notch信號(hào)通路最主要的受體之一，Notch1的表達(dá)水平與細(xì)胞增殖關(guān)系密切，且與轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子相互作用，對(duì)細(xì)胞的最終結(jié)局有影響〔11，12〕。Hes1是Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)靶基因之一，是一種基本的螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)抑制p27和p21等細(xì)胞周期抑制劑，發(fā)揮促進(jìn)增殖的作用〔13〕。目前在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)5種Notch配體：Delta-like(DLL)1、DLL3、DLL4及Jagged1、Jagged2。其中Jagged1是哺乳動(dòng)物中第1個(gè)被證實(shí)的Notch受體的配體，Jagged1受體在皮膚全層均有表達(dá)〔7，14〕。細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)器分子，即CSL DNA結(jié)合蛋白，在哺乳動(dòng)物中稱為RBP-Jκ〔15〕，是Notch信號(hào)通路中發(fā)揮關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。CBF-1/RBP-Jκ自身就是1個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制因子，可以特異性地與DNA序列“CGTGGGAA”結(jié)合，并招募SMRT、SKIP、Ⅰ/Ⅱ型組蛋白去乙?；傅鹊鞍仔纬晒惨种茝?fù)合物，對(duì)下游基因的轉(zhuǎn)錄起到抑制作用。DAPT是一種新型的γ-分泌酶抑制劑，能夠有效抑制細(xì)胞膜表面γ-分泌酶的活性，繼而阻斷Notch信號(hào)活化過(guò)程中的S3剪切，阻止受體胞內(nèi)段的產(chǎn)生，使Notch受體分子無(wú)法進(jìn)一步轉(zhuǎn)變成有效的活性片段，是Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的特異性阻斷劑〔16，17〕。許多研究表明，Notch信號(hào)通路在增殖分化過(guò)程中起到關(guān)鍵性作用。它參與了間質(zhì)干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、表皮干細(xì)胞、腫瘤干細(xì)胞等多種干細(xì)胞的分化。有文獻(xiàn)表明，持續(xù)表達(dá)的Hes1通過(guò)抑制DLL1及Jagged1配體抑制Notch通路，從而抑制胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化〔18〕。Lowell等〔19〕研究發(fā)現(xiàn)高水平表達(dá)Deltal的表皮干細(xì)胞，對(duì)鄰近細(xì)胞的Deltal配體不敏感，從而阻斷Notch信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，加強(qiáng)了干細(xì)胞簇的黏附，干細(xì)胞得以保護(hù)，同時(shí)干細(xì)胞通過(guò)自身高水平Deltal激活周邊細(xì)胞的Notch信號(hào)，使之分化成短暫擴(kuò)充細(xì)胞。說(shuō)明阻斷Notch通路可以維持表皮干細(xì)胞的特性，阻止其向表皮細(xì)胞分化。反之，增強(qiáng)Notch通路則可促進(jìn)分化〔20〕。研究發(fā)現(xiàn)，Notch抑制還會(huì)減少角膜緣上皮干細(xì)胞的分化和增殖，而Notch激活可促進(jìn)其分化和增殖〔21〕。

本研究結(jié)果說(shuō)明，Notch信號(hào)通路中的Notch1、Jagged1、RBP-Jκ和Hes1表達(dá)量與表皮干細(xì)胞的分化有關(guān)，老鼠年齡越大，表皮干細(xì)胞向表皮細(xì)胞的分化越多，表明表皮干細(xì)胞的特性發(fā)生異?？赡苁菍?dǎo)致皮膚衰老的原因之一；經(jīng)DAPT阻斷Notch通路后，結(jié)果說(shuō)明補(bǔ)益營(yíng)衛(wèi)方可以通過(guò)降低Notch信號(hào)通路中Notch1、Jagged1、RBP-Jκ和Hes1基因及蛋白表達(dá)水平，抑制表皮干細(xì)胞分化，維持表皮干細(xì)胞活性，阻止其向表皮細(xì)胞分化?！秲?nèi)經(jīng)》認(rèn)為，營(yíng)衛(wèi)和諧是人體生命活動(dòng)運(yùn)行的基礎(chǔ)，與皮膚的生理病理及衰老密切相關(guān)。營(yíng)衛(wèi)的盛衰是影響皮膚狀態(tài)的重要因素。補(bǔ)益營(yíng)衛(wèi)方中人參補(bǔ)營(yíng)衛(wèi)之氣；生黃芪益氣固衛(wèi)，炙甘草益氣調(diào)和諸藥，三藥合用，共奏補(bǔ)益營(yíng)衛(wèi)之功。研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)益營(yíng)衛(wèi)方可以抑制衰老皮膚表皮細(xì)胞的凋亡〔22〕，提高表皮干細(xì)胞活性，對(duì)衰老皮膚表皮穩(wěn)態(tài)有促進(jìn)作用〔23〕。

綜上，補(bǔ)益營(yíng)衛(wèi)方聯(lián)合DAPT可以有效抑制Notch通路的活性，而抑制Notch信號(hào)通路有利于延緩皮膚衰老。補(bǔ)益營(yíng)衛(wèi)方延緩皮膚衰老的機(jī)制很可能與有效抑制衰老皮膚表皮干細(xì)胞Notch信號(hào)通路中的Notch1、Jagged1、RBP-Jκ和Hes1基因及蛋白表達(dá)水平密切相關(guān)。