梁偉 陳艷妹 齊杰 康玉明

(1西安醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，陜西 西安 710309；2西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

糖尿病(DM)是以機(jī)體常年糖代謝紊亂為典型癥狀的代謝性疾病〔1，2〕。目前有證據(jù)顯示DM 及其并發(fā)癥的生理病理性發(fā)展與Toll樣受體(TLR)4密切相關(guān)：DM時(shí)機(jī)體存在 TLR4 高表達(dá)，激活的 TLR4 及其相關(guān)信號(hào)通路可通過調(diào)控多種炎性細(xì)胞因子的釋放參與 DM 病理性進(jìn)展，也可通過介導(dǎo)氧化應(yīng)激和細(xì)胞異常凋亡引發(fā)DM不良轉(zhuǎn)歸〔3～5〕。特異性阻斷 TLR4 或敲除相關(guān)基因，DM 時(shí)期的胰島素抵抗得以改善〔6～8〕。然而相關(guān)研究多集中于外周，中樞研究較少。下丘腦室旁核(PVN) 是調(diào)節(jié)機(jī)體能量代謝的主要中樞核團(tuán)之一〔9～12〕。然而PVN TLR4 是否參與DM不良病變，將其阻斷后能否成為治療 DM 的新靶點(diǎn)，目前尚未見到相關(guān)研究報(bào)道。本研究以2型DM(T2DM) 大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過PVN靶向給予TLR4特異性抑制劑(TAK-242)，研究PVN TLR4 阻斷對(duì)T2DM大鼠糖代謝的影響，并從神經(jīng)-內(nèi)分泌角度探討可能的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物及分組 健康雄性、體重160～180 g的SD大鼠由西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)入?；A(chǔ)飼料飼喂大鼠1 w后，利用隨機(jī)數(shù)表法將大鼠分為：正常對(duì)照(NC+PVN vehicle)組、正常干預(yù)(NC+PVN TAK-242)組、DM(DM+PVN vehicle)組、DM干預(yù)(DM+PVN TAK-242)組。

1.2主要試劑儀器 TAK-242購(gòu)自美國(guó)MCE公司；鏈脲佐菌素(STZ)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；葡萄糖和丙酮酸購(gòu)自上海金賽醫(yī)藥化工有限公司；胰島素購(gòu)自賽諾菲。大鼠腦立體定位儀MP-8003和動(dòng)物手術(shù)顯微鏡 XTL-3400購(gòu)自深圳瑞沃德生命科技有限公司；穩(wěn)豪/倍易型血糖儀和血糖試紙購(gòu)自強(qiáng)生(中國(guó))醫(yī)療器材有限公司；冷凍切片機(jī) CM1900購(gòu)自德國(guó) LEICA；Western印跡電泳槽、轉(zhuǎn)膜機(jī)、成像分析儀等購(gòu)自美國(guó)伯樂公司。

1.3主要實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1T2DM大鼠模型制備 高脂高糖飼料〔13〕飼喂SD大鼠4 w。飼喂結(jié)束后大鼠禁食 12 h，腹腔注射小劑量 STZ(35 mg/kg) 1次，3 d 后經(jīng)尾靜脈采血檢測(cè)大鼠空腹血糖(FBG)，血糖水平 ≥11.1 mmol/L的大鼠認(rèn)為建模成功。正常組大鼠則飼喂正常飼料，根據(jù)體重給予同等體積比例的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。

1.3.2PVN插管術(shù)及給藥 大鼠稱重后施行腹腔麻醉(鹽酸氯胺酮90 mg/kg 和乙酰丙嗪7.5 mg/kg)，剃毛后將頭部固定在腦立體定位儀上，參照 Paxinos 和 Watson 的大鼠腦立體定位圖譜定位PVN區(qū)域(前囟后 1.6～2.1 mm，中線兩側(cè)0.3～0.5 mm，垂直7.0～8.0 mm)，將套管植入大鼠PVN中，并利用樹脂膠和螺釘在頭蓋骨上固定，微型滲透微泵(2006型)連接PVN套管后埋入皮下。手術(shù)成功率約為68%，術(shù)后大鼠分籠飼養(yǎng)，以 0.11 μl/h連續(xù)28 d輸注TAK-242或人工腦嵴液(ACSF)。經(jīng)PVN輸注治療的大鼠用于研究分析。

1.3.3大鼠體重和FBG監(jiān)測(cè) 在大鼠開始給藥后每周固定時(shí)間測(cè)量各組體重和FBG。利用體重計(jì)稱取大鼠體重；大鼠禁食不禁水12 h，尾靜脈取血測(cè)量大鼠FBG。測(cè)量4 w。

1.3.4大鼠糖代謝水平監(jiān)測(cè) 葡萄糖耐量試驗(yàn)(GTT)、胰島素耐量試驗(yàn)(ITT)和丙酮酸耐量試驗(yàn)(PTT)檢測(cè)各組大鼠體內(nèi)糖代謝水平。大鼠禁食不禁水 12 h，腹腔注射15%葡萄糖(2 g/kg)、胰島素(1 U/kg)、丙酮酸(2 g/kg)，鼠尾靜脈采血記錄各組大鼠0、15、30、60、120 min 的血糖值，計(jì)算相對(duì)血糖變化比值(相對(duì)血糖變化=即時(shí)血糖/0 min血糖)，以算出的數(shù)值為統(tǒng)計(jì)值繪制曲線，以血糖曲線下面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)意義比較。

1.3.5腎交感神經(jīng)放電(RSNA)檢測(cè) 大鼠稱重后施行腹腔麻醉，剃毛、固定、消毒后，右側(cè)腰部縱形切口后清楚暴露腎臟，分離腎交感神經(jīng)并浸潤(rùn)石蠟油后，將分離出的腎交感神經(jīng)懸空掛于銀絲電極，利用BL-420S 監(jiān)測(cè)記錄RSNA。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，滴加硝普鈉測(cè)量最大RSNA，后切斷腎交感神經(jīng)，記錄背景噪音。實(shí)際RSNA減去背景噪音后占最大RSNA的百分比，用作統(tǒng)計(jì)學(xué)意義比較。

1.3.6Western印跡檢測(cè) Western印跡檢測(cè)PVN中還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶(NOX)4(Santa Cruz)、Cu-Zn 超氧化物歧化酶(SOD,Santa Cruz)、酪氨酸羥化酶(TH，Abcam)、谷氨酸脫羧酶67(GAD67，Abcam)蛋白表達(dá)。參照Kang等〔14〕所述提取PVN中總蛋白，將稀釋的總蛋白載入十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上，電泳分離目的蛋白，采用半干轉(zhuǎn)的方法將目的蛋白轉(zhuǎn)置聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%牛血清白蛋白封閉后孵育一抗(β-actin 1∶2 000，NADPH 1∶1 000，Cu-Zn SOD 1∶800，TH 1∶1 000，GAD67 1∶800)過夜，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌(6 min×4次)，用稀釋的二抗(1∶2 000)孵育2 h，洗滌后滴加現(xiàn)配的電化學(xué)發(fā)光(ECL)液并置于Western成像分析儀中發(fā)光、觀察并保存結(jié)果。采用 NIH ImageJ軟件進(jìn)行圖像灰度分析，以目的蛋白占β-actin的百分比用作統(tǒng)計(jì)學(xué)意義比較。

1.3.7二氫乙啶(DHE)、免疫熒光和免疫組化 參照Kang〔14〕所述收集各組大鼠PVN區(qū)域的腦部切片，DHE(sigma，1∶300)檢測(cè)活性氧簇(ROS)水平，免疫熒光檢測(cè)TLR4(abcam，1∶50)和TH(1∶200)陽(yáng)性神經(jīng)元表達(dá)，免疫組化檢測(cè)神經(jīng)元激活標(biāo)志物(c-FOS，Santa Cruz，1∶100)、NF-κB通路激活標(biāo)志物(p-IKKβ，Santa Cruz，1∶100)。在Nikon 熒光顯微鏡下觀察組織各抗體陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量表達(dá)并拍照記錄。對(duì)腦組織切片PVN核團(tuán)部位5個(gè)視野進(jìn)行熒光強(qiáng)度分析作為DHE數(shù)據(jù)結(jié)果，對(duì)腦組織切片PVN核團(tuán)部位5個(gè)視野進(jìn)行TLR4、TH、c-FOS、p-IKKβ陽(yáng)性神經(jīng)元計(jì)數(shù)作為免疫熒光和免疫組化數(shù)據(jù)結(jié)果。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行兩兩比較的方差分析，所有定量資料正式統(tǒng)計(jì)分析之前，均經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1慢性輸注TAK-242對(duì)T2DM大鼠PVN中TLR4陽(yáng)性神經(jīng)元的影響 如圖1、表1所示：與NC+PVN vehicle和NC+PVN TAK-242組相比，DM+vehicle和DM+TAK-242組PVN中TLR4陽(yáng)性神經(jīng)元顯著高表達(dá)(P<0.05)。DM+PVN TAK-242相比于DM+PVN vehicle組，PVN中TLR4陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目顯著降低(P<0.05)，表明TLR4被有效阻斷。

圖1 免疫熒光檢測(cè)各組PVN中TLR4 陽(yáng)性神經(jīng)元表達(dá)(×200)

2.2PVN阻斷TLR4對(duì)T2DM大鼠體重的影響 如表1所示：DM+PVN vehicle組和 DM+PVN TAK-242組給藥后2～4 w體重較NC+PVN vehicle和NC+PVN TAK-242組顯著下降(P<0.05)。DM+PVN TAK-242組較DM+PVN vehicle組給藥后體重下降減緩，并在給藥后4 w時(shí)體重有顯著差異(P<0.05)。表明PVN靶向給TAK-242可有效控制T2DM大鼠體重的減少。

2.3PVN阻斷TLR4對(duì)T2DM大鼠空腹血糖的影響 如表2所示：DM+PVN vehicle組和 DM+PVN TAK-242組較NC+PVN vehicle組和NC+PVN TAK-242組給藥期間FBG顯著升高(P<0.01)。DM+PVN TAK-242組較DM+PVN vehicle組，慢性輸注TAK-242后3～4 w時(shí)，F(xiàn)BG并未繼續(xù)升高并且逐漸趨于平穩(wěn)，但血糖值沒有出現(xiàn)顯著差異，表明PVN給予TAK-242一定程度上可控制T2DM大鼠FBG的上升。

2.4PVN阻斷TLR4對(duì)T2DM大鼠糖代謝的影響 與NC+PVN vehicle和NC+PVN TAK-242組比較，DM+PVN vehicle組和 DM+PVN TAK-242組在空腹注射15%葡萄糖60 min和120 min時(shí)，相對(duì)血糖變化值出現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)，在空腹注射胰島素30 min、60 min和120 min時(shí)，相對(duì)血糖變化值出現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)，表明T2DM大鼠體內(nèi)存在胰島素抵抗。DM+PVN TAK-242組相比DM+PVN vehicle組，在空腹注射15%葡萄糖120 min時(shí)相對(duì)血糖變化值出現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)，表明PVN給予TAK-242可有效增加T2DM大鼠機(jī)體內(nèi)胰島素敏感性，抑制胰島素抵抗，然而在空腹注射胰島素后的各時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)血糖變化值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明PVN給予TAK-242對(duì)T2DM大鼠肌肉等組織攝取葡萄糖的敏感性改善作用不顯著。與NC+vehicle和NC+TAK-242組比較，DM+PVN vehicle和 DM+PVN TAK-242組在空腹注射丙酮酸60 min和120 min時(shí)，相對(duì)血糖變化值出現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)，表明T2DM大鼠體內(nèi)存在糖異生。與DM+PVN vehicle組比較，DM+PVN TAK-242組在空腹注射丙酮酸后的120 min相對(duì)血糖變化值出現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)，表明PVN給予TAK-242可顯著降低T2DM大鼠體內(nèi)的糖異生能力。見圖2。

表1 各組PVN中TLR4陽(yáng)性神經(jīng)元表達(dá)及給藥后不同時(shí)間體重比較

表2 各組給藥不同時(shí)間FBG比較

(a)各組不同時(shí)刻GTT變化；(b) 各組不同時(shí)刻葡萄糖耐量變化；(c)各組不同時(shí)刻PTT變化； NC+PVN vehicle組， NC+PVN TAK-242組， DM+PVN vehicle組， DM+PVN TAK-242組圖2 室旁核TLR4阻斷對(duì)T2DM大鼠胰島素抵抗的影響

2.5PVN阻斷TLR4對(duì)T2DM大鼠腎交感神經(jīng)活性的影響 與NC+vehicle和NC+TAK-242組比較，DM+PVN vehicle和 DM+PVN TAK-242組RSNA最大百分比顯著增加(P<0.05)，表明T2DM大鼠體內(nèi)存在交感神經(jīng)激活；與DM+PVN vehicle 組比較，DM+PVN TAK-242 組RSNA最大百分比顯著降低(P<0.05)，表明PVN阻斷TLR4可降低T2DM大鼠交感神經(jīng)活性。見表3、圖3。

表3 各組RSNA最大百分比、PVN中NOX4、Cu-Zn SOD蛋白相對(duì)表達(dá)、ROS活性、TH及 GAD67蛋白表達(dá)

圖3 各組RSNA

2.6PVN阻斷TLR4對(duì)T2DM大鼠中樞氧化應(yīng)激的影響 與NC+vehicle和NC+TAK-242組比較，DM+PVN vehicle和 DM+PVN TAK-242組NOX4 蛋白表達(dá)水平顯著升高，Cu-Zn SOD 蛋白表達(dá)水平顯著降低，ROS活性顯著升高(P<0.05)，表明T2DM

大鼠PVN中存在氧化應(yīng)激。與DM+vehicle組比較，DM +TAK-242組NOX4 蛋白表達(dá)和ROS活性顯著降低(P<0.05)。表明PVN阻斷TLR4可降低T2DM大鼠中樞氧化應(yīng)激。見表3、圖4、圖5。

圖4 各組PVN中NOX4、Cu-Zn SOD蛋白表達(dá)

圖5 各組PVN中ROS活性表達(dá)(DHE，×40)

2.7PVN阻斷TLR4對(duì)T2DM大鼠中樞神經(jīng)遞質(zhì)的影響 與NC+vehicle和NC+TAK-242組比較，DM+PVN vehicle和 DM+PVN TAK-242組TH蛋白表達(dá)水平顯著升高，GAD67蛋白表達(dá)水平顯著降低，TH陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量顯著增多(P<0.05)。表明T2DM大鼠PVN中樞存在興奮性神經(jīng)遞質(zhì)和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的失平衡。與DM+vehicle組比較，DM+TAK-242組TH蛋白表達(dá)水平降低，GAD67蛋白表達(dá)水平升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；TH陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量顯著減少(P<0.05)，表明PVN阻斷TLR4可改善T2DM大鼠中樞神經(jīng)遞質(zhì)的失平衡，進(jìn)而降低外周交感神經(jīng)活性。見表3、圖6、圖7。

圖6 各組PVN中TH、GAD67蛋白表達(dá)

2.8PVN阻斷TLR4對(duì)T2DM大鼠中樞神經(jīng)元凋亡的影響 DM+PVN vehicle組和 DM+PVN TAK-242組相比于NC+vehicle和NC+TAK-242組PVN 中 P-IKKβ、c-FOS陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目明顯增多(P<0.05)，提示T2DM時(shí) PVN 神經(jīng)元中 TLR4/NF-κB信號(hào)通路被顯著激活，神經(jīng)元出現(xiàn)大范圍凋亡；DM+PVN TAK-242組P-IKKβ、c-FOS陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目顯著低于DM+PVN vehicle組(P<0.05)。見圖8、表4。

圖7 免疫熒光檢測(cè)各組PVN中TH陽(yáng)性神經(jīng)元表達(dá)(×400)

圖8 免疫組化檢測(cè)各組PVN中P-IKKβ、c-FOS陽(yáng)性神經(jīng)元表達(dá)

表4 各組PVN中P-IKKβ、c-FOS陽(yáng)性神經(jīng)元 表達(dá)

3 討 論

本研究結(jié)果表明PVN TLR4阻斷改善T2DM大鼠糖代謝。PVN是交感神經(jīng)系統(tǒng)重要的整合中樞，直接或者間接參與交感神經(jīng)的調(diào)控〔14～16〕，提示PVN可能通過調(diào)控交感神經(jīng)活性影響DM進(jìn)程。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，T2DM 大鼠腎交感神經(jīng)存在過度激活，證明了外周交感神經(jīng)激活是 T2DM 發(fā)病的重要機(jī)制之一，這與以往學(xué)者的觀點(diǎn)是相一致的〔17,18〕；特異性阻斷T2DM大鼠PVN TLR4后，可顯著降低外周交感神經(jīng)活性，改善T2DM大鼠糖代謝。

交感神經(jīng)活性受中樞各種神經(jīng)內(nèi)分泌因素調(diào)控。氧化應(yīng)激是ROS蓄積損傷組織的病理狀態(tài)。機(jī)體ROS的產(chǎn)生主要依賴機(jī)體細(xì)胞利用葡萄糖時(shí)進(jìn)行的氧化磷酸化反應(yīng)，NADPH參與其中主要擔(dān)當(dāng)遞氫體的角色；ROS的清除則主要依賴于SOD、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-px)等抗氧化酶系。本研究結(jié)果說明PVN TLR4阻斷能降低中樞氧化應(yīng)激，進(jìn)而降低交感神經(jīng)活性。

中樞神經(jīng)遞質(zhì)的異常紊亂可以造成機(jī)體交感神經(jīng)活性發(fā)生異常。去甲腎上腺素是一種重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，體內(nèi)調(diào)控去甲腎上腺素合成的關(guān)鍵限速酶之一是TH，腦內(nèi)TH含量可以反映去甲腎上腺素能神經(jīng)纖維終末中樞分布情況。γ-氨基丁酸是一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，始終貫穿于神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中并控制γ-氨基丁酸合成的關(guān)鍵限速酶之一是GAD67。本研究結(jié)果表明，T2DM大鼠PVN內(nèi)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)發(fā)生紊亂；PVN TLR4阻斷對(duì)中樞神經(jīng)遞質(zhì)有影響，但不明顯。

中樞神經(jīng)元非正常、大范圍的凋亡是DM引發(fā)的神經(jīng)退行性疾病的重要發(fā)病機(jī)制〔19,20〕。TLR4/NF-κB信號(hào)通路激活可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔20〕，P-IKKβ是NF-κB活化經(jīng)典途徑的關(guān)鍵亞基；神經(jīng)元c-Fos表達(dá)一定程度上可預(yù)測(cè)細(xì)胞凋亡即將發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)T2DM大鼠相比于正常大鼠TLR4/NF-κB信號(hào)通路過度激活、PVN神經(jīng)元凋亡異常。特異性阻斷T2DM大鼠室旁核TLR4后發(fā)現(xiàn)，T2DM大鼠中樞TLR4/NF-κB信號(hào)通路不能建立，PVN神經(jīng)元異常凋亡現(xiàn)象被逆轉(zhuǎn)。

綜上，下丘腦PVN TLR4阻斷可一定程度改善T2DM大鼠糖代謝，其可能通過抑制中樞氧化應(yīng)激和神經(jīng)元凋亡，平衡興奮性神經(jīng)遞質(zhì)和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，降低外周交感神經(jīng)活性機(jī)制展開。本研究為中樞使用TLR4特異性抑制劑治療T2DM提供了相應(yīng)實(shí)驗(yàn)證據(jù)。