張馳 王國玉 陳軍 崔琮 曹俊杰

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 1神經(jīng)內(nèi)科,河北 承德 067000;2老年病科;3中國人民解放軍91236部隊(duì)醫(yī)院)

高血壓在老年人群中發(fā)病率高達(dá)40%～50%，具有血壓波動(dòng)大、收縮壓明顯增高、晨峰高血壓等特點(diǎn)，可導(dǎo)致心、腦、腎等多種靶器官損害。調(diào)查顯示，我國高血壓患者數(shù)目達(dá)3.3億，其中約75%伴有血漿同型半胱氨酸(Hcy)增高，稱為H型高血壓〔1〕。研究證實(shí)，高血壓狀態(tài)及高Hcy血癥在導(dǎo)致靶器官損害上有明顯協(xié)同作用〔2〕。腎損害是高血壓常見的靶器官損害之一，是導(dǎo)致腎硬化和終末期腎病的重要原因〔3〕。臨床常以降壓藥物控制血壓來防治老年高血壓腎損害，但老年患者常合并多種基礎(chǔ)疾病，對藥物的耐受性降低，治療較青中年患者更復(fù)雜，療效受限。研究發(fā)現(xiàn)高血壓腎損害具有人群異質(zhì)性，屬于多基因遺傳病，與多種基因多態(tài)性相關(guān)〔4〕。亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)是Hcy代謝過程中的關(guān)鍵酶之一，其基因C667T位點(diǎn)突變是誘發(fā)H型高血壓的重要原因〔5，6〕。研究發(fā)現(xiàn)，MTHFR C677T基因突變參與了高血壓心腦血管動(dòng)脈粥樣硬化的病理過程，是高血壓并發(fā)心、腦靶器官損害的危險(xiǎn)因素〔7〕，但目前關(guān)于MTHFR C677T基因多態(tài)性與H型高血壓腎損害的相關(guān)性研究報(bào)道少見。本研究擬分析MTHFR C677T基因多態(tài)性與H型高血壓腎損害的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1研究對象 本研究通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批，所有受試者簽署知情同意書。選取2020年8月至2021年4月承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院老年病科及全科醫(yī)療科198例老年H型高血壓患者，其中男121例、女77例，平均年齡(70.19±5.68)歲，高血壓病程(8.24±1.75)年。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)確診為H型高血壓；(2)年齡60～80歲；(3)各項(xiàng)臨床資料清晰完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)繼發(fā)性高血壓；(2)原發(fā)性腎疾??；(3)合并糖尿病、甲狀腺疾病、惡性腫瘤、血液系統(tǒng)疾病、免疫性疾病、肝腎功能障礙、急慢性感染及嚴(yán)重心腦血管疾病者；(4)近3個(gè)月內(nèi)有手術(shù)或輸血史；(5)近3個(gè)月內(nèi)有維生素(V)B6、VB12、葉酸等影響Hcy代謝藥物治療史。

1.2診斷標(biāo)準(zhǔn)及分組 H型高血壓診斷標(biāo)準(zhǔn)〔8〕：原發(fā)性高血壓，且血漿Hcy水平≥10 μmol/L。高血壓腎損害診斷標(biāo)準(zhǔn)〔9〕：原發(fā)性高血壓，且估算的腎小球?yàn)V過率(eGFR)<90 ml/(min·1.73 m2)。eGFR使用簡化腎臟病膳食改良實(shí)驗(yàn)(MDRD)公式計(jì)算，eGFR=175×肌酸酐(Cr)-1.23×年齡-0.18×性別(男=1.00，女=0.79)。將H型高血壓患者根據(jù)是否合并腎損害分為高血壓腎損害(HRD)組(n=75)和單純高血壓(HNRD)組(n=123)，另選取同期體檢的老年非高血壓患者為對照組(n=40)。

1.3一般資料收集 收集所有受試者性別、年齡、高血壓病程(H型高血壓)、體重指數(shù)(BMI)、吸煙史、飲酒史、收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)、高血壓家族史。

1.4樣本采集 所有受試者在入院第2日采集清晨空腹外周靜脈血3 ml×2，其中3 ml放入乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管搖勻，-80℃下保存，用于基因多態(tài)性檢測；另3 ml同樣加入抗凝管，用于生化指標(biāo)檢測。

1.5實(shí)驗(yàn)室生化指標(biāo)檢測 由專業(yè)檢驗(yàn)科人員使用全自動(dòng)生化分析儀(7600型，日本日立)進(jìn)行Hcy、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、Cr、尿素氮(BUN)、尿酸(UA)等生化指標(biāo)的測定，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)應(yīng)用DG022A型酶聯(lián)免疫檢測儀，試劑盒購自北京九強(qiáng)生物技術(shù)有限公司。

1.6基因多態(tài)性檢測 MTHFR C677T基因型檢測：全血冷凍樣本經(jīng)37℃水浴融化后，取500 μl加入DNA快速提取試劑盒中，核酸提取試劑購自上海復(fù)星長征有限公司，使用全自動(dòng)磁珠核酸提取儀(SLE-E13200)進(jìn)行DNA提取，-20℃保存。使用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)(PCR-熒光探針法)進(jìn)行MTHFR C677T基因片段的擴(kuò)增，儀器為實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Cobas-z-480)，基因檢測試劑盒購于深圳泰樂德醫(yī)療有限公司。MTHFR C677T擴(kuò)增引物序列：上游：5′-TGAAGAGAAGGTGTCTGCGGA-3′；下游：5′-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3′。引物由北京閱微基因技術(shù)有限公司提供。PRC體系：50 μl，模板DNA 2 μg，2×Master Mix 25 μl，上下游引物各2 μl。PCR條件：第一階段50℃ 2 min 1個(gè)循環(huán)；第二階段95℃ 2 min 1個(gè)循環(huán)，第三階段95℃ 15 s、60℃ 1 nin 45個(gè)循環(huán)；信號收集：第三階段60℃時(shí)收集FAM和VIC熒光信號，執(zhí)行實(shí)時(shí)PCR。根據(jù)PCR和熒光法檢測MTHFR C677C/T多態(tài)性位點(diǎn)的基因型。根據(jù)最終循環(huán)兩熒光通道數(shù)據(jù)在二維坐標(biāo)進(jìn)行基因分型。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS24.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)；Hardy-Weinberg遺傳平衡的檢驗(yàn)采取χ2檢驗(yàn)；并應(yīng)用Logistic回歸模型分析H型高血壓合并腎損害的影響因素。

2 結(jié) 果

2.1各組一般資料及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較 與對照組相比，HRD組及HNRD組SBP、DBP、Hcy、TC、LDL-C、Cr、BUN、UA水平及有高血壓家族史比例均明顯更高(P<0.05)；與HNRD組相比，HRD組Hcy、LDL-C、Cr水平明顯更高，高血壓病程明顯更長(P<0.05)。3組性別、年齡、BMI等其他指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組一般資料及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較

2.2Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn) HRD組、HNRD組和對照組MTHFR C677T基因型包括CC型、CT型、TT型，各組MTHFR C677T基因型均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡(χ2=0.483、0.599、1.042，P均>0.05)，群體代表性良好。

2.3各組MTHFR C677T基因型和等位基因分布頻率比較 與對照組相比，HRD組及HNRD組CC基因型頻率明顯更低(P<0.05)，且HRD組CC基因型頻率明顯低于HNRD組，CT基因型頻率明顯高于HNRD組(P<0.05)；3組TT基因型頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。HRD組及HNRD組C等位基因及T等位基因分布頻率與對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；且HNRD組與HRD組C等位基因及T等位基因分布頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.4H型高血壓合并腎損害相關(guān)因素的Logistic回歸分析 以H型高血壓是否合并腎損害為因變量，以單因素分析中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)為自變量(高血壓病程、Hcy、Cr、LDL-C賦值均為原值，MTHFR C677T基因型賦值以CC型或CT型=0、TT型=1)，行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，高血壓病程、Hcy、Cr、LDL-C及MTHFR C677T基因T等位基因是H型高血壓患者發(fā)生腎損害的獨(dú)立影響因素。見表3。

表2 各組MTHFR C677T基因型和等位基因分布頻率比較〔n(%)〕

表3 H型高血壓合并腎損害相關(guān)因素的Logistic回歸分析

3 討 論

老年H型高血壓患者由于肝腎功能減退、代謝功能下降，對降壓藥物的敏感性和耐受性較青中年患者變化明顯，更易發(fā)生藥物不良反應(yīng)，給臨床防治高血壓腎損害帶來一定難度。研究表明〔10〕，MTHFR基因多態(tài)性在多種疾病如H型高血壓、腎衰竭等的發(fā)生發(fā)展中作用重要。葉酸循環(huán)是蛋氨酸代謝的重要組成部分，MTHFR則是葉酸循環(huán)中的關(guān)鍵代謝酶，可降低Hcy濃度。MTHFR基因的第677位密碼子易發(fā)生不耐熱錯(cuò)義突變(C突變?yōu)門)，使丙氨酸(Ala)因此轉(zhuǎn)變?yōu)槔i氨酸(Val)，MTHFR熱穩(wěn)定性下降，活性也隨之下降，N5-甲基四氫葉酸合成不足導(dǎo)致Hcy甲基化供體缺乏，最終造成Hcy代謝受阻，細(xì)胞內(nèi)外Hcy濃度上升。H型高血壓即是原發(fā)性高血壓合并高Hcy血癥，研究〔11〕證實(shí)，MTHFR參與了H型高血壓的病理過程，其作用機(jī)制可能在于：MTHFR 的CT、TT基因型活性明顯較CC型降低(65%、30% vs 100%)，導(dǎo)致Hcy代謝障礙，Hcy含量升高而發(fā)為高Hcy血癥。Bottiglieri〔12〕也指出，MTHFR C677T基因多態(tài)性是血漿Hcy水平出現(xiàn)中、重度增高的原因之一。對比國內(nèi)外不同人群的MTHFR C677T基因中T等位基因突變情況，以非洲人群的頻率最低(4.9%～9%)，歐洲人群最高(24%～40%)，中國人群則在30%～60%〔13，14〕，處于較高水平。向海卿等〔15〕研究也提示MTHFR C677T基因多態(tài)性是H型高血壓的危險(xiǎn)因素。因此，根據(jù)MTHFR基因型予以老年患者個(gè)性化治療，可能更有效地防治高血壓腎損害，進(jìn)而降低患者的治療費(fèi)用、節(jié)約醫(yī)療資源。本研究結(jié)果顯示，對照組、HNRD組、HRD組的T等位基因分布頻率與既往上述結(jié)果基本相符〔15〕，提示H型高血壓發(fā)生率高是中國高血壓人群特征之一，臨床應(yīng)對患者血漿Hcy水平予以關(guān)注。

高Hcy濃度可增強(qiáng)血液黏度、損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞等，造成血栓、血管內(nèi)皮功能障礙，這可能是高Hcy血癥可誘發(fā)多種疾病的基礎(chǔ)。Pushpakumar等〔16〕發(fā)現(xiàn)，Hcy可通過DNA低甲基化、氧化還原信號等機(jī)制和途徑來誘發(fā)腎血管重構(gòu)，導(dǎo)致腎小球、腎小管損傷。Dong等〔17〕發(fā)現(xiàn)，高血壓患者腎功能的下降與MTHFR C677T基因多態(tài)性關(guān)系密切。故可推測MTHFR C677T基因多態(tài)性可能通過提高Hcy濃度來誘發(fā)腎損害。王海利等〔18〕也提示高血壓患者的Hcy水平與靶器官損傷程度呈正相關(guān)。本研究提示MTHFR C677T基因多態(tài)性與H型高血壓患者腎損害的發(fā)生密切相關(guān)。LDL-C、Cr水平均是H型高血壓腎損害的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。這可能由于Hcy可通過加重機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)來增加外周血中的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，刺激損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞〔19〕；高Hcy也會激活腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)、刺激血管緊張素Ⅱ分泌，將進(jìn)一步加重高血壓，損傷腎功能〔20〕。提示高血壓和高Hcy血癥在腎損害上可能具有協(xié)同作用。Qin等〔21〕研究還指出，MTHFR C677T基因多態(tài)性除影響Hcy濃度外，還影響葉酸對高血壓的療效，其結(jié)果顯示，TT基因型患者在使用葉酸后血漿Hcy并無明顯降低，這可能與MTHFR TT基因型活性過低有關(guān)。提示臨床在診治H型高血壓患者時(shí)還應(yīng)關(guān)注其MTHFR C677T基因型，避免盲目用藥，增加患者經(jīng)濟(jì)和生理負(fù)擔(dān)。

綜上，MTHFR C677T基因多態(tài)性與老年H型高血壓患者腎損害易感性密切相關(guān)，等位基因T會增加老年H型高血壓患者發(fā)生腎損害的風(fēng)險(xiǎn)。臨床對于H型高血壓患者可予以基因型檢測，為臨床用藥提供科學(xué)依據(jù)，以期改善預(yù)后。