王敏鑫，金會(huì)艷，陳德多，邊 慧

（昆明醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500）

兩棲類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物不僅容易獲得，且其坐骨神經(jīng)、心肌及骨骼肌等標(biāo)本在離體后保存條件易于控制，另外標(biāo)本離體后保持生理活性的時(shí)間較長(zhǎng)，因此常用于機(jī)能學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)與科學(xué)研究[1-4]。局麻藥是一類局部應(yīng)用于神經(jīng)末梢或神經(jīng)干，能可逆性阻斷神經(jīng)沖動(dòng)的產(chǎn)生與傳導(dǎo)，在意識(shí)清醒的條件下使局部感覺(jué)暫時(shí)消失的藥物[5]。本研究以牛蛙離體坐骨神經(jīng)干為研究對(duì)象，以坐骨神經(jīng)干產(chǎn)生所需的閾強(qiáng)度與最大刺激強(qiáng)度、坐骨神經(jīng)干復(fù)合動(dòng)作電位的傳導(dǎo)速度與復(fù)合動(dòng)作電位幅度、坐骨神經(jīng)干的興奮不應(yīng)期等電生理學(xué)參數(shù)為指標(biāo)，觀察局麻藥布比卡因?qū)εＭ茏巧窠?jīng)干復(fù)合動(dòng)作電位的影響，以期為機(jī)能學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)提供參考，還可以為了解布比卡因?qū)ι窠?jīng)系統(tǒng)的影響提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器與藥品

BL-420F 生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（購(gòu)自成都泰盟科技有限公司）、蛙類手術(shù)器械、神經(jīng)屏蔽盒。0.75%鹽酸布比卡因注射液（購(gòu)自上海朝暉藥業(yè)有限公司）、標(biāo)準(zhǔn)配方任氏液。

1.3 坐骨神經(jīng)干標(biāo)本制備

按照常規(guī)方法[6-7]制備牛蛙離體坐骨神經(jīng)干標(biāo)本，盡可能分離出較長(zhǎng)的神經(jīng)干，在分離過(guò)程中需減少對(duì)神經(jīng)干的損傷，避免金屬器械或手觸碰神經(jīng)干，且在此過(guò)程中不斷滴加任氏液以保持神經(jīng)干的活性。將分離好的牛蛙坐骨神經(jīng)干置于任氏液中浸泡20 min，當(dāng)其達(dá)到興奮性穩(wěn)定后分組實(shí)驗(yàn)，其中一組為任氏液對(duì)照組，使用任氏液浸泡坐骨神經(jīng)干（n=8）；另外一組為布比卡因?qū)嶒?yàn)組，使用0.75% 的鹽酸布比卡因浸泡神經(jīng)干1 min（n=7）。

牛蛙雌雄混用，體重250 ～300 g，由昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施許可證編號(hào)SYXK（滇）K2020-0006。

1.4 坐骨神經(jīng)干復(fù)合動(dòng)作電位產(chǎn)生所需閾強(qiáng)度與最大刺激強(qiáng)度的測(cè)定

將坐骨神經(jīng)干標(biāo)本置于神經(jīng)屏蔽盒，其中坐骨神經(jīng)干的中樞端接觸刺激電極，外周端接觸記錄電極。設(shè)置單脈沖連續(xù)刺激，逐漸增加刺激強(qiáng)度，找出剛能引出微小神經(jīng)干復(fù)合動(dòng)作電位的刺激強(qiáng)度，即為坐骨神經(jīng)干復(fù)合動(dòng)作電位產(chǎn)生所需的閾強(qiáng)度；繼續(xù)增加刺激強(qiáng)度，神經(jīng)干動(dòng)作電位幅度相應(yīng)增大，直至動(dòng)作電位幅度不能繼續(xù)升高為止，此時(shí)即為坐骨神經(jīng)干復(fù)合動(dòng)作電位的最大刺激強(qiáng)度[8]。

1.5 坐骨神經(jīng)干復(fù)合動(dòng)作電位傳導(dǎo)速度的測(cè)定

使用BL-420F 生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)內(nèi)置的區(qū)間測(cè)量工具，測(cè)量從刺激偽跡至坐骨神經(jīng)干復(fù)合動(dòng)作電位起點(diǎn)之間的時(shí)間，然后測(cè)量神經(jīng)屏蔽盒內(nèi)刺激電極中點(diǎn)到第一對(duì)記錄電極之間的距離，通過(guò)公式“速度=距離/ 時(shí)間”計(jì)算得出坐骨神經(jīng)干復(fù)合動(dòng)作電位的傳導(dǎo)速度[9]。

1.6 坐骨神經(jīng)干復(fù)合動(dòng)作電位幅度的測(cè)定

使用單脈沖電刺激，設(shè)置刺激強(qiáng)度為3 V（此強(qiáng)度需大于坐骨神經(jīng)干復(fù)合動(dòng)作電位的最大刺激強(qiáng)度）。神經(jīng)干復(fù)合動(dòng)作電位經(jīng)第1 對(duì)記錄電極引導(dǎo)，使用BL-420F 生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)內(nèi)置的區(qū)間測(cè)量工具，測(cè)量坐骨神經(jīng)干復(fù)合動(dòng)作電位上相波頂點(diǎn)與下相波最低點(diǎn)之間的幅度，此值即為坐骨神經(jīng)神經(jīng)干復(fù)合動(dòng)作電位的幅度[10]。

1.7 坐骨神經(jīng)干興奮不應(yīng)期的測(cè)定

設(shè)置雙脈沖刺激，起始波間隔時(shí)間設(shè)定為8 ms，波間隔減量設(shè)定為0.1 ms。隨著雙脈沖刺激波間隔逐漸縮短，第二個(gè)動(dòng)作電位不斷向第一個(gè)動(dòng)作電位靠近；當(dāng)波間隔減小到一定程度時(shí)，第二個(gè)動(dòng)作電位幅度開(kāi)始減小，此時(shí)的波間隔代表不應(yīng)期持續(xù)時(shí)間；繼續(xù)縮短雙脈沖刺激的波間隔，第二個(gè)動(dòng)作電位幅度繼續(xù)減小直至消失，此時(shí)的波間隔代表絕對(duì)不應(yīng)期持續(xù)時(shí)間，以不應(yīng)期減去絕對(duì)不應(yīng)期得出相對(duì)不應(yīng)期[11-12]。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 布比卡因?qū)εＭ茈x體坐骨神經(jīng)干復(fù)合動(dòng)作電位閾強(qiáng)度、最大刺激強(qiáng)度的影響

經(jīng)非配對(duì)t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)組間差異，結(jié)果如圖1 所示，與任氏液對(duì)照組比較，布比卡因?qū)嶒?yàn)組牛蛙離體坐骨神經(jīng)干復(fù)合動(dòng)作電位產(chǎn)生所需的閾強(qiáng)度及最大刺激強(qiáng)度均顯著增加〔（0.31±0.04）V vs.（0.49±0.14）V；（0.55±0.06）V vs.（0.69±0.11）V 〕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＜0.01）。

圖1 布比卡因?qū)εＭ茈x體坐骨神經(jīng)干復(fù)合動(dòng)作電位閾強(qiáng)度、最大刺激強(qiáng)度的影響

2.2 布比卡因?qū)εＭ茈x體坐骨神經(jīng)干復(fù)合動(dòng)作電位幅度、傳導(dǎo)速度的影響

經(jīng)非配對(duì)t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)組間差異，結(jié)果如圖2、圖3 所示，與任氏液對(duì)照組比較，布比卡因?qū)嶒?yàn)組牛蛙離體坐骨神經(jīng)干復(fù)合動(dòng)作電位的幅度及傳導(dǎo)速度均顯著 減 小〔（6.42±2.32）mV vs.（0.60±0.47）mV ；（27.27±1.06）m/s vs.（19.87±2.80）m/s 〕， 差 異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＜0.001）。

圖2 布比卡因?qū)εＭ茈x體坐骨神經(jīng)干復(fù)合動(dòng)作電位幅度的影響

圖3 布比卡因?qū)εＭ茈x體坐骨神經(jīng)干復(fù)合動(dòng)作電位傳導(dǎo)速度的影響

2.3 布比卡因?qū)εＭ茈x體坐骨神經(jīng)干絕對(duì)不應(yīng)期、相對(duì)不應(yīng)期的影響

經(jīng)非配對(duì)t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)組間差異，結(jié)果如圖4 所示，與任氏液對(duì)照組比較，布比卡因?qū)嶒?yàn)組牛蛙離體坐骨神經(jīng)干的絕對(duì)不應(yīng)期及相對(duì)不應(yīng)期均顯著延長(zhǎng)〔（1.63±0.17）ms vs.（2.08±0.29）ms；（1.22±0.33）ms vs.（2.52±0.44）ms〕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01；P＜0.001）。

圖4 布比卡因?qū)εＭ茈x體坐骨神經(jīng)干絕對(duì)不應(yīng)期、相對(duì)不應(yīng)期的影響

3 討論

神經(jīng)科學(xué)研究表明，神經(jīng)細(xì)胞傳導(dǎo)功能的關(guān)鍵是動(dòng)作電位的產(chǎn)生和傳導(dǎo)，動(dòng)作電位的產(chǎn)生是神經(jīng)細(xì)胞傳遞信息功能的基礎(chǔ)；而神經(jīng)細(xì)胞動(dòng)作電位的產(chǎn)生依賴于電壓門控鈉通道大量開(kāi)放導(dǎo)致的Na+ 內(nèi)流[13]。迄今為止，很難用一種理論來(lái)解釋局麻藥的作用機(jī)制，不同局麻藥可能有不同的作用方式。關(guān)于局麻藥的作用機(jī)制有以下學(xué)說(shuō)：鈣離子學(xué)說(shuō)、表面電荷學(xué)說(shuō)、膜膨脹學(xué)說(shuō)、受體學(xué)說(shuō)等，其中比較公認(rèn)的是受體學(xué)說(shuō)。該學(xué)說(shuō)認(rèn)為局麻藥受體可能存在多個(gè)部位，一個(gè)在鈉通道內(nèi)口附近，對(duì)解離型局麻藥分子有較強(qiáng)親和力，另一個(gè)在鈉通道與膜結(jié)構(gòu)交界面，非解離型局麻藥更容易進(jìn)入[13]。布比卡因是臨床常用的酰胺類局麻藥，該藥主要作用于神經(jīng)細(xì)胞膜電壓門控鈉通道上的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)；當(dāng)其與鈉通道內(nèi)側(cè)受體結(jié)合后，導(dǎo)致鈉通道蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，鈉通道關(guān)閉，阻滯Na+內(nèi)流，進(jìn)而阻止動(dòng)作電位的產(chǎn)生及傳導(dǎo)[5]。本研究中將局麻藥布比卡因作用于牛蛙離體坐骨神經(jīng)干后，顯示神經(jīng)干復(fù)合動(dòng)作電位的傳導(dǎo)速度減慢，產(chǎn)生該現(xiàn)象的原因可能是布比卡因?qū)е码妷洪T控鈉通道構(gòu)象改變，繼而引起Na+內(nèi)流減少，動(dòng)作電位傳導(dǎo)變慢。

神經(jīng)干動(dòng)作電位是由許多閾值、傳導(dǎo)速度及幅度不同的神經(jīng)纖維產(chǎn)生的動(dòng)作電位疊加形成的綜合性電位變化，稱為復(fù)合動(dòng)作電位[11]。由于組成神經(jīng)干的神經(jīng)纖維興奮性高低不盡相同，因此當(dāng)刺激強(qiáng)度低于閾強(qiáng)度時(shí)，沒(méi)有復(fù)合動(dòng)作電位產(chǎn)生；當(dāng)刺激強(qiáng)度較小時(shí)，僅可使少數(shù)興奮性較高的神經(jīng)纖維興奮，疊加后產(chǎn)生較小的復(fù)合動(dòng)作電位；隨著刺激強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，興奮的神經(jīng)纖維數(shù)逐漸增加，疊加后的復(fù)合動(dòng)作電位幅度也會(huì)相應(yīng)增大；當(dāng)刺激強(qiáng)度達(dá)到最大值時(shí)，會(huì)使全部神經(jīng)纖維都興奮，疊加后的復(fù)合動(dòng)作電位幅度達(dá)到最大，即使此時(shí)再增加刺激強(qiáng)度，復(fù)合動(dòng)作電位幅度也不會(huì)再增加[11]。因此，神經(jīng)干復(fù)合動(dòng)作電位的幅度在一定范圍內(nèi)表現(xiàn)為隨刺激強(qiáng)度增加而增加的特征，其幅度取決于興奮的神經(jīng)纖維數(shù)量[14]。閾強(qiáng)度是衡量組織細(xì)胞興奮性高低的常用指標(biāo)，其數(shù)值大小與興奮性之間呈反變關(guān)系[15]。當(dāng)局麻藥布比卡因作用于坐骨神經(jīng)神經(jīng)干后，因布比卡因可與電壓門控鈉通道內(nèi)側(cè)受體結(jié)合，導(dǎo)致Na+ 內(nèi)流被抑制，神經(jīng)興奮性降低，因此需要更大強(qiáng)度的刺激才能興奮神經(jīng)，故此時(shí)牛蛙坐骨神經(jīng)干復(fù)合動(dòng)作電位產(chǎn)生所需的閾強(qiáng)度、最大刺激強(qiáng)度均增大[16]。

單根神經(jīng)纖維動(dòng)作電位表現(xiàn)為“全”或“無(wú)”的特征，其動(dòng)作電位升支頂點(diǎn)接近Na+ 平衡電位。當(dāng)局麻藥與鈉通道內(nèi)側(cè)受體結(jié)合后，由于鈉通道阻斷導(dǎo)致單根神經(jīng)纖維動(dòng)作電位的幅度下降甚至消失[15]，因此疊加后的坐骨神經(jīng)干復(fù)合動(dòng)作電位幅度也隨之減小。神經(jīng)纖維在一次興奮后，需要經(jīng)過(guò)一定時(shí)間（不應(yīng)期）的恢復(fù)，然后才能產(chǎn)生第二次興奮。其興奮性恢復(fù)時(shí)間的長(zhǎng)短不僅取決于鈉鉀泵轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間，還與電壓門控鈉通道、電壓門控鉀通道開(kāi)放速度及開(kāi)放時(shí)的電導(dǎo)率有關(guān)[17-18]。本研究結(jié)果顯示，布比卡因?qū)е屡Ｍ茈x體坐骨神經(jīng)干的絕對(duì)不應(yīng)期、相對(duì)不應(yīng)期均延長(zhǎng)，這可能和布比卡因與電壓門控鈉通道的內(nèi)側(cè)受體結(jié)合，進(jìn)而導(dǎo)致鈉通道蛋白構(gòu)象發(fā)生改變有關(guān)。

綜上所述，布比卡因可增加神經(jīng)干復(fù)合動(dòng)作電位的閾強(qiáng)度和最大刺激強(qiáng)度、降低神經(jīng)干復(fù)合動(dòng)作電位幅度、減慢神經(jīng)干復(fù)合動(dòng)作電位傳導(dǎo)速度及延長(zhǎng)不應(yīng)期，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。