鐘 倩,吳洪瀚,吳恒鵬,陳 偉,方 琴,瓦慶德

(遵義醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院,貴州 遵義 563000)

前列腺癌是威脅男性健康的常見疾病,研究前列腺癌的發(fā)病、侵襲及轉(zhuǎn)移機(jī)制等生物學(xué)特性具有重要臨床意義[1]。前列腺癌的發(fā)病與基因異常變化密切相關(guān),但它們在前列腺癌發(fā)生及發(fā)展中的作用機(jī)制尚不明確[2-3]。隨著對腫瘤發(fā)病機(jī)制的深入研究和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷發(fā)展,前列腺癌轉(zhuǎn)基因動物模型的研究取得了重要進(jìn)展,該動物模型通過控制目的基因的表達(dá)影響前列腺癌疾病特征,為前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律和防治研究提供了重要的平臺。

20世紀(jì)60年代,人們開始嘗試以大鼠建立動物模型研究前列腺癌,但由于該模型很少顯示轉(zhuǎn)移灶,在研究中的應(yīng)用有限[4-5]。一個理想的前列腺癌轉(zhuǎn)基因動物模型應(yīng)該在不干擾免疫系統(tǒng)的基礎(chǔ)上,保留與腫瘤發(fā)生相關(guān)的遺傳和表觀遺傳學(xué)變化,且擁有較短的成瘤期和較高的腫瘤外顯率,從而為前列腺癌的臨床評估與治療提供更全面、更準(zhǔn)確的參考依據(jù)[6]。目前雖然沒有一個模型可以獨(dú)立滿足所有標(biāo)準(zhǔn),但各類模型相互關(guān)聯(lián)形成的多元化信息網(wǎng)絡(luò)有助于我們開發(fā)出更先進(jìn)的模型。

1 常用轉(zhuǎn)基因模型

既往研究[7-8]表明,抑癌基因p53和rb突變(缺失、失活等)會導(dǎo)致雄激素抵抗性前列腺癌,而猴病毒40(SV40)產(chǎn)生的抗原(T、t)正好可以阻斷rb和p53的信號通路,并在小鼠的前列腺上皮特異性表達(dá),進(jìn)一步誘導(dǎo)小鼠發(fā)生前列腺癌。當(dāng)前利用不同來源的啟動子與SV40大T、小t抗原相結(jié)合構(gòu)建了一系列轉(zhuǎn)基因動物模型,最常用的啟動子有大鼠PB基因(probasin)、前列腺分泌蛋白94基因(PSP94)、大鼠前列腺類固醇結(jié)合蛋白基因[C3(1)]、小鼠α-防御素-2基因(Cryptdin-2)、胎兒Gγ-球蛋白基因(Gγ-globin)等[9]。

1.1 TRAMP轉(zhuǎn)基因模型 TRAMP模型[PB(-426/+28)-SV40 Large T/small t]具有廣泛轉(zhuǎn)移的特性,是目前最符合前列腺癌臨床病理特征的模型[10]。TRAMP模型利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將雄激素依賴性及前列腺組織特異性蛋白rPB導(dǎo)入小鼠受精卵中,通過PB的啟動子片段調(diào)控SV40大T、小t抗原的表達(dá),進(jìn)而誘導(dǎo)小鼠前列腺癌發(fā)生與發(fā)展[11]。TRAMP模型中可觀察到前列腺從上皮增生到侵襲性腺癌再到全身多處廣泛轉(zhuǎn)移的進(jìn)行性發(fā)展過程[12]。TRAMP小鼠8周齡時可在前列腺背側(cè)葉檢測到豐富的SV40大T抗原標(biāo)記;在10周齡左右時,在前列腺背外側(cè)葉出現(xiàn)低級別上皮內(nèi)瘤變,并逐漸進(jìn)展為高級別上皮內(nèi)瘤變;在12周齡時,開始出現(xiàn)前列腺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,并在28周齡時全部發(fā)展為轉(zhuǎn)移性前列腺癌,成瘤率為100%[13]。其中,大多數(shù)腫瘤發(fā)生于前列腺背側(cè)葉,并伴有腹盆淋巴結(jié)、肺、肝及皮下轉(zhuǎn)移,其中腹盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為60%,肺臟轉(zhuǎn)移率為30%,肝臟及皮下組織轉(zhuǎn)移率各為10%[14]。與自發(fā)和誘導(dǎo)模型相比,TRAMP模型可控性更佳,包含了小鼠前列腺癌從激素敏感性上皮內(nèi)瘤變到非激素依賴浸潤性癌以及轉(zhuǎn)移性癌的全過程,并提高了成瘤率(100%發(fā)病率)。因此,該模型多用于前列腺癌特定發(fā)病過程及其轉(zhuǎn)移特性的研究[12,15]。

1.2 LADY轉(zhuǎn)基因模型 LADY模型[PB(-11.5/+28)-SV40 Large T]應(yīng)用大鼠PB啟動子中包含額外雄激素和生長因子反應(yīng)序列的長片段(-11.5/+28),攜帶SV40并于小鼠前列腺特異性表達(dá)其大T抗原[16-17]。在該模型已建立的7個不同轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平和不同表型的品系中,僅12T-10品系存在轉(zhuǎn)移性病變,并可進(jìn)展為晚期腺癌[17]。該品系的獨(dú)特之處在于將轉(zhuǎn)基因序列插入小鼠X染色體后,可觀察到前列腺組織從具有神經(jīng)內(nèi)分泌特征的上皮內(nèi)瘤變(PIN)發(fā)展為侵襲性神經(jīng)內(nèi)分泌癌[16]。在該模型中,小鼠6月齡時可在一個部位發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶,9～10月齡時可在多個部位發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶,但只有14%的小鼠模型發(fā)生了骨轉(zhuǎn)移,侵襲性前列腺癌通常轉(zhuǎn)移至淋巴結(jié)、肝、肺、脾、腎等部位,偶見骨轉(zhuǎn)移[6]。LADY模型選擇性表達(dá)大T抗原并剔除小t抗原的方式,使其特異性具備神經(jīng)內(nèi)分泌特征。然而,該模型中前列腺癌細(xì)胞增殖能力受限,不具備TRAMP轉(zhuǎn)基因模型的強(qiáng)侵襲性[18]。因此,該模型常用于探討前列腺神經(jīng)內(nèi)分泌癌的發(fā)生與發(fā)展機(jī)制。

1.3 C3(1)轉(zhuǎn)基因模型 大鼠前列腺類固醇結(jié)合蛋白構(gòu)建的C3(1)-SV40Large T/small t小鼠模型由C3(1)啟動子驅(qū)動SV40大T抗原的表達(dá),是第一個前列腺癌轉(zhuǎn)基因動物模型[6]。然而,C3(1)基因的調(diào)節(jié)區(qū)域 5’端缺乏重要的調(diào)控元件,無法將其表達(dá)局限于前列腺組織中,因此在尿道、膀胱和唾液腺中也可觀察到轉(zhuǎn)基因表達(dá)[19]。此外,有學(xué)者利用大鼠C3(1)基因5’端和第一外顯子中的激素反應(yīng)元件構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因動物模型證實(shí)C3(1)基因的表達(dá)具有性激素依賴性[20-21]。在該模型中,所有雌性小鼠在6個月大的時候都會患上乳腺癌;雄性小鼠8月齡左右時即出現(xiàn)前列腺增生,最終進(jìn)展為上皮內(nèi)瘤變甚至是前列腺癌,偶爾還會轉(zhuǎn)移到其他組織,如肺和骨[22]。該模型的非靶向性及性激素依賴型,致使該模型中可能存在一種組織含多種腫瘤特征或者腫瘤在前列腺以外器官中表達(dá)的情況。但是,該轉(zhuǎn)基因模型中前列腺癌發(fā)展過程是高度可預(yù)測的,并且發(fā)生的時間相對較長,可用于研究激素反應(yīng)元件及前列腺從正常組織到癌變的多階段進(jìn)展過程[23]。

1.4 Cryptdin-2轉(zhuǎn)基因模型 Cryptdin-2/SV40 Large T模型利用了小鼠Cryptdin-2基因-6500到+34位核苷酸,引導(dǎo)FVb/N小鼠前列腺各神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞亞群表達(dá)SV40大T抗原,使其發(fā)展為神經(jīng)內(nèi)分泌型前列腺癌[24]。該模型最初建立后主要用于研究小腸Paneth細(xì)胞的作用。然而,在該品系小鼠5～7月齡時,雄性轉(zhuǎn)基因小鼠均死于前列腺腫瘤。通過進(jìn)一步研究,人們注意到SV40大T抗原在導(dǎo)致成熟Paneth細(xì)胞丟失的同時,會在前列腺中定向表達(dá)。CR2-TAG小鼠在8周齡時,即TAG表達(dá)開始后1周,發(fā)生前列腺上皮內(nèi)瘤變。2～4周后出現(xiàn)侵襲期,16周內(nèi)出現(xiàn)淋巴結(jié)、肝、肺、腦和骨轉(zhuǎn)移[25]。該模型存在兩個顯著優(yōu)勢:其一,轉(zhuǎn)基因動物模型疾病特征的表達(dá)并不依賴于雄激素,因此雌性轉(zhuǎn)基因小鼠生長發(fā)育與非轉(zhuǎn)基因雌性(或雄性)同窩動物相同;其二,該模型在復(fù)刻人類前列腺癌多種組織病理學(xué)特征的同時,避免了神經(jīng)內(nèi)分泌來源的前列腺癌進(jìn)化中對雄激素的依賴性[24,26]。與TRAMP模型相比,該模型成瘤周期更短,并為臨床診斷前列腺癌神經(jīng)內(nèi)分泌分化提供了新的生物標(biāo)志物。

1.5 Gγ-globin轉(zhuǎn)基因模型 既往研究[27]發(fā)現(xiàn),在胎兒Gγ-globin 啟動子與SV40大T抗原病毒癌基因相連(Gγ/T-15)的轉(zhuǎn)基因小鼠模型中,本該表達(dá)于胚胎紅系組織中的基因結(jié)構(gòu),可在前列腺中表達(dá)并進(jìn)展為前列腺癌。而大T抗原僅表達(dá)于成人前列腺,胎兒及新生兒前列腺均不能檢測到該抗原,這表明前列腺癌的進(jìn)展與雄激素密切相關(guān)。當(dāng)對表達(dá)前列腺癌疾病特征的小鼠進(jìn)行去勢處理后,并沒有阻止前列腺癌的發(fā)展,這證明該前列腺癌是雄激素非依賴性的,因此Gγ/T-15轉(zhuǎn)基因品系可作為一種高侵襲性雄激素非依賴性轉(zhuǎn)移性前列腺癌模型。此外,有75%的半合子和100%的純合子轉(zhuǎn)基因雄鼠發(fā)生前列腺癌,提示了T抗原的劑量效應(yīng),因此該模型與神經(jīng)內(nèi)分泌的關(guān)系還有待進(jìn)一步探討[28]。該模型無需使用免疫缺陷小鼠,能較為準(zhǔn)確地模仿侵襲性和轉(zhuǎn)移性人類前列腺癌進(jìn)展過程,為缺乏特定靶向治療的非雄激素依賴性轉(zhuǎn)移性前列腺癌提供了特征性的生物標(biāo)記物及潛在治療方法。然而,胎兒珠蛋白啟動子并非前列腺特異性的,因此其他器官也有腫瘤病變,因此該模型具有一定的局限性[27]。

1.6 PSP-KIMAP轉(zhuǎn)基因模型 該模型利用PSP94基因啟動子/增強(qiáng)子靶向調(diào)控小鼠前列腺并特異性地表達(dá)SV40大T/小t抗原[29]。前列腺上皮細(xì)胞分泌的PSP94能在人和小鼠的前列腺中特異性表達(dá),故可用于早期診斷和治療前列腺癌[30]。PSP-KIMAP小鼠模型復(fù)現(xiàn)了部分人類前列腺癌的特征,在10周齡左右可觀察到前列腺上皮內(nèi)瘤變,而在24周時進(jìn)展為侵襲性腺癌并伴有淋巴結(jié)、肺和肝臟等遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[24]。與TRAMP模型和LADY模型相比,該模型更能模擬人體前列腺癌發(fā)生與發(fā)展過程,其具備更穩(wěn)定的表型與更精確的前列腺組織靶向性[16]。目前PSP-KIMAP轉(zhuǎn)基因模型品系研究尚不完善,但其在復(fù)刻前列腺癌方面是值得肯定的,可作為其他模型的補(bǔ)充,應(yīng)用前景廣闊。

2 轉(zhuǎn)基因模型在前列腺癌研究中的應(yīng)用

近年來轉(zhuǎn)基因鼠模型廣泛應(yīng)用于腫瘤發(fā)病機(jī)制的研究、腫瘤藥物的篩選及腫瘤的基因治療。Connelly等[31]通過LADY轉(zhuǎn)基因模型測試Foxy2是否激活雄激素受體(AR)反應(yīng)啟動子并促進(jìn)T抗原的表達(dá)。Elisia等[32]運(yùn)用C3(1)-SV40 大T/小t轉(zhuǎn)基因模型研究癌變狀態(tài)下低碳水化合物(CHO)飲食對機(jī)體血糖、胰島素、IL-6、TNF-α等指標(biāo)的影響,以反映前列腺癌的葡萄糖依賴性差異。Varghese等[33]通過SV40 T抗原驅(qū)動的TRAMP前列腺癌模型發(fā)現(xiàn),自然殺傷T細(xì)胞(iNKT細(xì)胞)表達(dá)的一種半不變量T細(xì)胞受體可與某些糖脂(如α-半乳糖基神經(jīng)酰胺)結(jié)合,從而分泌大量干擾素γ以增強(qiáng)抗腫瘤藥物粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)的抗腫瘤作用,為進(jìn)一步開發(fā)利用iNKT細(xì)胞激活的治療疫苗提供思路,為腫瘤的臨床治療打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

3 小結(jié)與展望

以上各轉(zhuǎn)基因模型都是依賴于SV40表達(dá)的大T、小t抗原聯(lián)合不同的啟動子建立起來的。目前已知曉大T、小t抗原都與廣泛的細(xì)胞通路相互作用并影響其功能。大T抗原的插入可以消除抑癌基因p53和rb的功能,可能打破細(xì)胞正常生長的穩(wěn)態(tài),并可能進(jìn)一步導(dǎo)致遺傳的不穩(wěn)定性。同時,小t抗原的表達(dá)通過阻斷蛋白質(zhì)磷酸酶-2A(PP2A)的功能性表達(dá),從而維持促癌蛋白激酶通路的持續(xù)活性,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長和存活。這些轉(zhuǎn)基因動物模型的臨床特征會因腫瘤發(fā)病時間不同而受到干擾,可能導(dǎo)致腫瘤生長潛伏期較長,或者骨轉(zhuǎn)移傾向較低。此外,該模型中的致癌過程是在病毒蛋白的幫助下啟動的,但病毒蛋白與人類前列腺癌發(fā)展的相關(guān)性尚不清楚。

參與調(diào)控前列腺癌進(jìn)展的因素多且復(fù)雜,而轉(zhuǎn)基因動物模型能再現(xiàn)前列腺癌的各個階段,對于研究前列腺癌的病因、早期預(yù)防和潛在治療方法具有重大意義。但轉(zhuǎn)基因模型費(fèi)用高、周期長,裸鼠難形成大體積瘤體,并且難以控制腫瘤的異質(zhì)性帶來的基因表達(dá)偏差,因此前列腺癌轉(zhuǎn)基因動物模型仍有待深入研究。未來可以嘗試構(gòu)建成瘤期較短、針對腫瘤的異質(zhì)性且能綜合模擬體內(nèi)前列腺癌發(fā)生與發(fā)展及轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)基因動物模型,為前列腺癌的機(jī)制研究、藥物研究和防治方法提供更理想的研究模型。