李 敏，程富勝，郭麗華，周凱仁，白玉彬，李 冰，魏彥明，張繼瑜*

(1.甘肅農業(yè)大學動物醫(yī)學院，甘肅蘭州 730070；2.中國農業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅蘭州 730050；3.山東德州神牛藥業(yè)有限公司，山東德州 253000)

隨著全球養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，大規(guī)模集約化養(yǎng)殖模式使畜禽的疾病呈現(xiàn)集中暴發(fā)趨勢，越來越多的抗生素、抗病毒藥物、抗真菌藥物和抗寄生蟲藥物在養(yǎng)殖場被廣泛使用。據(jù)統(tǒng)計，由胸膜肺炎放線桿菌、巴氏桿菌、支原體等病原菌引起的畜禽呼吸道疾病和泌乳動物乳房炎等疾病給全球養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重的危害和經濟損失。我國每年因畜禽呼吸道疾病和泌乳動物乳房炎造成的損失高達數(shù)十億元[1]。目前對于畜禽呼吸道疾病的防控主要是通過接種疫苗或使用恩諾沙星、阿莫西林和頭孢噻呋等抗生素藥物，由于病原菌的不斷變異，疫苗的保護范圍并不能全覆蓋，加上抗生素藥物的大量不規(guī)范使用，導致抗生素療效減弱，細菌耐藥性不斷增強。2014年世界衛(wèi)生組織(WHO)宣布細菌抗藥性已經成為人類面臨的十大全球公共衛(wèi)生威脅之一[2]。因此，亟需繼續(xù)研發(fā)更有效的新型獸藥來改善和適應畜禽疾病不斷變化的情況。

替米考星具有與其他大環(huán)內酯類抗生素類似的特性，是畜禽專用抗生素，對革蘭氏陽性細菌、某些革蘭氏陰性菌、部分支原體和螺旋體等有抑制作用[3-4]。由于其抗菌譜廣、吸收迅速、半衰期長、表觀分布容積大、組織穿透力強、在靶細胞中快速積累和低濃度抑制的特性，被認為是最安全的抗細菌感染的大環(huán)內酯類抗生素，在澳大利亞、意大利和美國，替米考星已經被批準用于預防和治療牛、山羊、綿羊、豬和雞的細菌性感染的治療，在中國已被批準用于治療豬和牛巴氏桿菌感染以及雞支原體感染[5-7]。但是，替米考星在胃內易受到胃酸破壞從而導致功效降低，加之存在溶解性差、滲透性差、適口性差、腸外排運和首過效應等諸多問題，導致生物利用度低，口服療效不佳[8]。因此，為了提高替米考星生物利用度，增加胃內穩(wěn)定性，降低在胃內的損耗，研發(fā)單位在原料藥的基礎上，采用不同的制備技術，研制出多種替米考星新型制劑。本試驗對新研制的3種替米考星不同口服顆粒制劑進行了溶出度測定，為替米考星新制劑的研發(fā)和臨床應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗藥品 替米考星標準品(含量95%，批號C17582000)，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH；替米考星顆粒1(供試樣品1，含量20%，批號20201006)、替米考星顆粒2(供試樣品2，含量20%，20201008)、替米考星顆粒3(供試樣品3，含量20%，20201103)由山東德州神牛藥業(yè)有限公司自主研發(fā)； 替米考星顆粒對照品(含量20%，批號20200310)，市售替米考星腸溶顆粒。

1.1.2 主要試劑 甲醇(色譜純)，美國Fisher公司產品；乙腈(色譜純)，美國Fisher公司產品；四氫呋喃(色譜純)，二丁胺(分析純)，美國sigma公司產品；磷酸(色譜純)，科密歐，天津科密歐化學試劑有限公司產品；NaOH(分析純)，鹽酸(分析純)，磷酸鈉(分析純)，國藥集團化學試劑有限公司產品；純水和超純水為試驗自制。

1.1.3 主要儀器 ME403型電子天平，瑞士Mettler Toledo公司產品；KQ-600DE數(shù)控超聲清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產品；UPT-Ⅱ-40L優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)，上海優(yōu)普實業(yè)有限公司產品；FE20實驗室pH計，德國Sartorius公司產品；溶出儀，德國Phmsa公司產品；Waters2695高效液相色譜儀，Waters2489紫外檢測器，美國Waters公司產品；針筒式微孔濾膜，孔徑0.22 μm，天津津騰實驗儀器有限公司產品；Hypersil ODS-2 C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，大連依利特分析儀器有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 Hypersil ODS-2 C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為水∶乙腈∶磷酸二丁胺緩沖液∶四氫呋喃(790∶130∶25∶55)；流速為1.0 mL/min；檢測波長為290nm；柱溫為30℃；進樣量為20 μL。

1.2.2 溶液配制

1.2.2.1 磷酸稀釋液 取900 mL水，加入5.71 g磷酸，用12.5 mol/L氫氧化鈉溶液調節(jié)pH至2.5±0.1，加水定容至1000 mL，搖勻即得。

1.2.2.2 對照品溶液 精確稱取替米考星對照品25 mg，置于50 mL容量瓶，加10 mL乙腈超聲使其溶解，用磷酸緩沖液定容至刻度線，搖勻即得。

1.2.2.3 供試品溶液 精確稱取25 mg替米考星待測品25 mg，置于50 mL容量瓶，加10 mL乙腈超聲使其溶解，用磷酸稀釋液定容至刻度線，搖勻即得。

1.2.2.4 溶出介質 根據(jù)《中國獸藥典》腸溶顆粒溶出度試驗方法，分別配制pH為1.0的酸溶液和pH為6.8的磷酸鹽緩沖液[9]。

1.2.3 含量測定方法學驗證

1.2.3.1 專屬性試驗 精確量取空白溶液(流動相)、對照品溶液和供試品溶液分別經0.22 μm微孔濾器過濾，注入色譜儀，依次進行樣品測定。

1.2.3.2 線性考察 精確稱取50 mg替米考星標準品，置于50 mL容量瓶中，加入10 mL乙腈，超聲使其溶解，加入磷酸稀釋液定容至刻度線，搖勻，配制成1 mg/mL的替米考星標準品母液待用。采用梯度稀釋法，取標準品母液配制成的質量濃度為10、50、100、200、400、600、800、1000 μg/mL的標準品溶液，精確量取20 μL注入色譜儀，記錄峰面積，以替米考星標準品的峰面積為縱坐標Y，以替米考星標準品的質量濃度(C)為橫坐標，繪制峰面積(Y)-質量濃度(C)標準曲線濃度，計算標準曲線的回歸方程。

1.2.3.3 回收率試驗 精確稱取替米考星標準品，用10 mL乙腈溶解，用磷酸緩沖液定容至10 mL容量瓶中，配制成80 μg/mL(低)、100 μg/mL(中)、120 μg/mL(高)3個質量濃度的對照品溶液，每各濃度的溶液分別進樣3次，測定每個樣品的實際質量濃度，根據(jù)實際質量濃度與理論質量濃度的比值，計算回收率及相對標準偏差(RSD)。

1.2.3.4 精密度試驗 精確稱取替米考星標準品，用10 mL乙腈溶解，用磷酸緩沖液定容至10 mL容量瓶中，配制成80 μg/mL(低)、100 μg/mL(中)、120 μg/mL(高)3個質量濃度的對照品溶液，分別考察日內精密度和日間精密度。

1.2.3.5 重復性試驗 按照1.2.2.3供試樣品配制方法，配制5份供試樣品溶液，分別經0.22 μm微孔濾器過濾，按照1.2.1色譜條件，精密吸取每個樣品溶液20 μl進樣，計算含量及其RSD值。

1.2.3.6 溶出度方法 根據(jù)溶出度與釋放度測定法中腸溶顆粒體外溶出度測定方法，用兩種介質對替米考星不同制劑(每種3個平行)進行體外溶出試驗，選用漿法，溶出介質體積為900 mL，轉速為75 r/min，溫度為37℃±0.5℃，用“1.2.2”中的方法配制酸和緩沖液兩種溶出介質，取樣時間點為5、10、15、20、30、40、50、60、75、90、120 min，取樣體積為5.0 mL(同時補液5.0 mL)，經濾膜過濾后測定樣品在不同溶出介質中的溶出情況，記錄峰面積，繪制溶出曲線。

1.2.4 溶出度方法學驗證

1.2.4.1 方法專屬性試驗 精確量取空白溶液、對照品溶液和供試品溶液分別經0.22 μm微孔濾器過濾，注入色譜儀，依次進行樣品測定。

1.2.4.2 穩(wěn)定性試驗 取本品90 mg，分別以酸和緩沖液900 mL為溶出介質，在5、10、15與30 min時，分別取5 mL溶液，同時在操作容器中補充溶出介質5 mL。濾過，取濾液適量，作為供試品溶液。然后分別在0、2、4、8、12、18、24 h注入液相色譜儀，記錄色譜圖。計算替米考星峰面積相對標準差。

1.2.4.3 濾膜吸附性試驗 取兩種溶出介質中120 min時的供試樣品溶液5 mL，分別經 0.22 μm、0.45 μm和0.8 μm微孔濾膜處理，取濾液20 uL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，比較峰面積大小。

1.2.5 統(tǒng)計分析方法 用Excel 2019初步整理試驗數(shù)據(jù)，用SPSS 26.0軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，并采用Duncan法多重比較，P>0.05定義為不具有顯著性差異，P<0.05定義為具有顯著性差異，P<0.01定義為具有極顯著性差異。

2 結果

2.1 含量測定

2.1.1 專屬性考察 結果見圖1和圖2，表明空白溶液對樣品含量測定無干擾，該方法專屬性強。

圖1 空白溶液

圖2 替米考星標準溶液色譜圖

2.1.2 線性考察 以替米考星標準品的質量濃度(C)為橫坐標，繪制峰面積(Y)-質量濃度(C)標準曲線，得到的標準曲線見圖3，線性回歸方程為y=26 971x-196 608,R2=0.999 6，表明替米考星在濃50 μg/mL～1000 μg/mL的質量濃度范圍內與對應的峰面積的線性關系良好。

圖3 替米考星標準曲線圖

2.1.3 回收率與精密度 替米考星的平均回收率為110.0%，RSD值均不大于2%，表明該方法的準確度較高。

2.1.4 重復性 按照1.2.2供試品的配置方法，分別配制5份供試樣品，測定5份替米考星含量RSD值分別為1.25%、1.65%、1.69%、1.97%和1.06%，表明該方法重復性良好。

2.1.5 替米考星不同制劑含量測定 結果顯示供試樣品替米考星含量均在標示量的90%～110%，結果見表1。

表1 不同替米考星供試樣品含量

2.2 溶出度

2.2.1 專屬性考察 結果表明，兩種溶出介質對替米考星的測定無干擾，該方法專屬性強(圖4～圖6)。

圖4 空白緩沖液色譜圖

圖5 空白酸色譜圖

圖6 替米考星供試樣品色譜圖

2.2.2 穩(wěn)定性 在不同時間段對供試品溶液進樣分析，替米考星峰面積的RSD值均小于2.0%，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定。

2.2.3 濾膜吸附性試驗 分別對3種濾過方式的峰面積進行比較，結果發(fā)現(xiàn)，3種濾膜濾過后峰面積無差異。說明濾膜對替米考星無吸附作用，故選擇最常用的0.22 μm PES濾膜過濾。

2.2.4 酸中溶出度 替米考星供試樣品1、供試樣品2、供試樣品3、替米考星對照樣品，在酸中的溶出度見圖7。結果顯示，供試樣品1在酸中溶解良好，累積溶出度為100%；供試樣品2在酸中的累積溶出度為5.73%，供試樣品3在酸中的累積溶出度為8.29%；替米考星對照樣品在酸中的累積溶出度為2.36%，因此只有供試樣品2和3符合獸藥典對替米考星腸溶制劑在酸中溶出度小于10%的規(guī)定。

圖7 不同替米考星供試樣品在酸中的溶出曲線

2.2.5 緩沖液中累積溶出度 替米考星供試樣品1、供試樣品2、供試樣品3、對照樣品在5、10、15、20、30、40、50、60、75、90、120 min時累積溶出度見圖8，結果顯示替米考星供試樣品1、2、3以及對照樣品在緩沖溶液中的累積溶出度分別為100%、97.53%、93.60%和93.15%。

圖8 不同替米考星供試樣品在緩沖液中的溶出曲線

3 討論

針對不同的動物和用藥途徑，目前市面上有許多不同劑型的替米考星制劑，包括可溶性粉末、預混劑、注射液、腸溶顆粒、固體脂質納米粒、固體分散體等[8,10-13]。臨床上預混劑、注射劑和腸溶顆粒最為常見。研究發(fā)現(xiàn)，替米考星預混劑口服給藥后，吸收迅速，但是吸收不完全，并且替米考星味極苦，適口性差，給藥比較困難[14]。通過對替米考星的注射劑研究發(fā)現(xiàn)，替米考星對心臟具有很強的毒性，進入血管的替米考星可以導致動物出現(xiàn)心動過速和心肌收縮力下降[10]。我國《獸藥典》明確指出給豬肌肉注射10 mg/kg的替米考星后，會出現(xiàn)呼吸急促、嘔吐和驚厥等不良反應，加大劑量至20 mg/kg進行肌肉注射時，大多數(shù)豬出現(xiàn)死亡等現(xiàn)象[9]。因此，同一種藥物，經過不同生產工藝和制備技術所得到的不同制劑，其藥物活性成分的釋放速度、吸收程度以及安全劑量范圍不盡相同。

試驗中3種替米考星供試樣品，為不同工藝和技術生產而成的顆粒制劑。研究結果顯示，在酸液中5 min替米考星供試樣品1累計溶出度已達63.83%，90 min可完全溶出，說明在酸性介質中，顆粒崩解快，能快速釋放出主藥成分，與對照品相比極顯著(P<0.01)；供試樣品2、3在5 min時，累積溶出度分別為2.56%和5.54%，與樣品1比有顯著性(P<0.05)，在90 min時累積溶出度分別為5.73%、8.29%，隨時間不斷增加，與其初測時間點溶出度相比較無顯著差異(P>0.05)，但于樣品1 在90 min的溶出度差異顯著(P<0.05)。從累積溶出度變化趨勢看，樣品1主要集中在40 min前，累積溶出度達到93%以上，40 min后溶出度速率變化不大；樣品2、樣品3累積溶出度速率變化與對照品變化趨勢基本相同，從5 min～90 min不同的測定時間點之間累積溶出度變化無顯著性差異(P>0.05)。

在磷酸鹽緩沖溶液中，5 min時，樣品1的累積溶出度明顯高于樣品2、樣品3和對照品，而樣品2、樣品3與對照品之間無明顯差異。在中間點60 min時，供試樣品1、2、3的累積溶出度分別為94.88%、90.23%和82.96%，對照樣品在60 min時累積溶出度為79.01%，3種供試樣品累積溶出度均高于對照樣品，其中樣品1的累積溶出度最高。120 min時試樣品1中替米考星已完全釋放，樣品2、樣品3和對照樣品的累積溶出度分別為97.53%、93.60%和93.15%，供試樣品之間、供試樣品與對照品之間累積溶出度均無顯著差異(P>0.05)。試驗結果表明，在緩沖溶液中，供試樣品均具有理想的溶出度。

試驗結果顯示，試驗中所用的供試樣品所采用的原輔料的不同直接影響了在酸和緩沖液中溶出度。供試樣品1未經過包被工藝直接由主藥替米考星與輔料加工而成的顆粒，在酸和緩沖液中均容易釋放出活性成分，供試樣品2和供試樣品3經過包被后，在酸中，溶出度呈下降趨勢，對原藥的釋放具有很強阻抗作用，包被所用材料和所形成的包被結構具有很強的耐酸性，與對照品的累積溶出度無顯著差異(P>0.05)。在磷酸鹽緩沖液中，供試樣品2和供試樣品3溶出度趨勢有差異性(P<0.05)，這主要與兩者的主藥成分有關，供試樣品2主藥為替米考星，而供試樣品3為磷酸修飾過的替米考星磷酸鹽，結果顯示出樣品2在緩沖溶液中具有良好的釋放效果。綜合酸和緩沖液中3種供試樣品的試驗結果，依據(jù)獸藥典的相關規(guī)定，供試樣品2、3均符合腸溶制劑在酸中溶出量小于10%，在緩沖液中供試樣品均符合累積溶出度不低于70%，與對照品相比較，均可以作為替米考星腸溶顆粒新制劑進一步研發(fā)，而供試樣品1不宜作為腸溶顆粒制劑研發(fā)。