劉露露 ，秦燕 ，孟國梁 ，顧錦華 ，張琳 包小燕 （.南通大學(xué)附屬婦幼保健院/南通市兒童醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇 南通 6007；.南通大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南通 600；.南通大學(xué)附屬婦幼保健院/南通市兒童醫(yī)院心電圖室，江蘇 南通 6007）

心肌纖維化是一種以心肌成纖維細(xì)胞基質(zhì)蛋白沉積為主要特征的心肌病理改變[1]。當(dāng)心肌缺血缺氧時(shí)，心肌成纖維細(xì)胞可過度激活，進(jìn)而造成心臟損傷[2]。雖然心肌成纖維細(xì)胞是心臟中數(shù)目最多的細(xì)胞，但在研究心臟生理功能和疾病機(jī)制過程中，對心肌成纖維細(xì)胞研究卻相對較少。硫化氫（hydrogen sulfide，H2S）是一種氣體信號分子[3]，在調(diào)節(jié)細(xì)胞信號傳導(dǎo)、抗炎、抗氧化等病理生理學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用[4]。去乙?；?（sirtuin 3，SIRT3）是組蛋白去乙?；涪蟮某蓡T之一，可參與感知細(xì)胞能量代謝，進(jìn)而維持氧化還原狀態(tài)的平衡[5]。H2S是一種具有抗氧化作用的氣體分子，SIRT3與線粒體功能和氧化應(yīng)激密切相關(guān)。既往研究證實(shí)，H2S可通過增強(qiáng)SIRT3的表達(dá)來改善血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，Ang Ⅱ）誘導(dǎo)的心肌肥大[6]。由于Ang Ⅱ會(huì)誘導(dǎo)心肌纖維化[7]，且既往研究發(fā)現(xiàn)H2S可以減輕阿霉素誘導(dǎo)的心肌纖維化[8]，但是目前尚不清楚SIRT3是否也在H2S抗Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌纖維化中起關(guān)鍵作用。因此，本研究擬采用硫氫化鈉（sodium hydrosulfide，NaHS）作為H2S供體，觀察SIRT3在H2S抗Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞增殖中的變化，揭示H2S抗心肌纖維化的新靶點(diǎn)，從而為臨床防治心肌纖維化相關(guān)疾病提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有AE-100型電子天平（美國Millipore公司）、SYNERGY H1型全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）、TCS SP8型激光共聚焦顯微鏡（德國Leica公司）、Chemidoc Tonch型化學(xué)發(fā)光顯影儀（美國Bio-Rad公司）、MVS-83型壓力蒸汽滅菌器（日本Panasonic產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社公司）、5424 R型高速臺式離心機(jī)（德國Eppendorf公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

青霉素-鏈霉素溶液（批號C0222）、胰蛋白酶（批號C0201）、CCK-8試劑盒（批號C0038）、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI，批號C1005）、Alexa Fluor 488標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗（批號A0423）和Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗（批號A0516）均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；DMEM（批號SH30021.01）購自美國Cytiva公司；胎牛血清（批號10099141C）購自美國Gibco公司；NaHS（批號16721-80-5）購自瑞士 Admas公司；Ang Ⅱ（批號 A9525，純度100%）購自美國Sigma-Aldrich公司；羥脯氨酸測定試劑盒（批號A030-1-1）購自南京建成生物工程研究所有限公司；脂質(zhì)體2000（批號11668-019）購自美國Invitrogen公司；兔源SIRT3、視神經(jīng)萎縮蛋白1（optic atrophy protein 1，OPA1）多克隆抗體均購自美國Santa Cruz Biotechnology公司，貨號分別為sc-365175、sc-393296；兔源Ⅰ型膠原（collagen Ⅰ，Col Ⅰ）、Ⅲ型膠原（collagen Ⅲ，Col Ⅲ）多克隆抗體均購自武漢博士德生物工程有限公司，貨號分別為BA2023、M00788；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phos-phate dehydrogenase，GAPDH）抗體（貨號GB12002）購自武漢賽維爾生物科技有限公司；SIRT3干擾RNA（SIRT3 siRNA，批號20180312-1）、陰性對照干擾RNA（negative control siRNA，NC siRNA；批號20180312-2）均購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

1～3 d齡的SD雄性大鼠（體質(zhì)量為5～8 g）由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，使用許可證號為SYXK（蘇）2017-0046，生產(chǎn)許可證號為SCXK（蘇）2019-0001。所有大鼠飼養(yǎng)于無菌環(huán)境中，溫度約為27 ℃，相對濕度約為55%，自由飲水、進(jìn)食。

2 方法

2.1 心肌成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)

取1～3 d新生SD雄性大鼠心臟，并用胰蛋白酶水浴消化，取出細(xì)胞懸液，留取沉淀（即細(xì)胞）于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)差速離心法分離心肌成纖維細(xì)胞。待細(xì)胞生長密度達(dá)到80%后傳代，采用第3代心肌成纖維細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 心肌成纖維細(xì)胞的分組、給藥與造模

將心肌成纖維細(xì)胞按每孔1 mL（密度為2×105個(gè)/mL）接種于6孔板中，待心肌成纖維細(xì)胞生長密度約60%時(shí)，將含10%胎牛血清的培養(yǎng)液換成含0.5%胎牛血清的培養(yǎng)液饑餓細(xì)胞24 h后，將細(xì)胞分為空白組、Ang Ⅱ組、Ang Ⅱ+NaHS組、NaHS組，每組6個(gè)復(fù)孔。Ang Ⅱ+NaHS組以及NaHS組中加入NaHS溶液（50 μmol/L）預(yù)處理4 h，Ang Ⅱ組以及Ang Ⅱ+NaHS組加入Ang Ⅱ溶液（100 nmol/L）刺激細(xì)胞24 h從而誘導(dǎo)產(chǎn)生心肌成纖維細(xì)胞增殖模型，觀察NaHS給藥后對心肌成纖維細(xì)胞增殖的影響。給藥劑量按參考相關(guān)文獻(xiàn)[6]設(shè)置。

2.3 心肌成纖維細(xì)胞增殖的檢測

細(xì)胞分組和處理同“2.2”項(xiàng)下，按照CCK-8試劑盒說明書方法進(jìn)行操作，檢測各組細(xì)胞的光密度（optical density，OD）值。

2.4 心肌成纖維細(xì)胞中羥脯氨酸含量的檢測

細(xì)胞分組和處理同“2.2”項(xiàng)下，按照羥脯氨酸測定試劑盒說明書方法進(jìn)行操作，利用試劑盒提供的羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品，按公式（羥脯氨酸含量＝各組樣品吸光度/標(biāo)準(zhǔn)品吸光度×標(biāo)準(zhǔn)品濃度）計(jì)算各組心肌成纖維細(xì)胞中羥脯氨酸含量。

2.5 心肌成纖維細(xì)胞中SIRT3蛋白表達(dá)水平的檢測

采用Western blot法進(jìn)行檢測。細(xì)胞分組和處理同“2.2”項(xiàng)下，用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞40 min，提取細(xì)胞總蛋白。將轉(zhuǎn)膜盒置于4 ℃環(huán)境中260 mA通電90 min，將轉(zhuǎn)好的膜于5%牛奶中封閉2 h，加入SIRT3（稀釋比為1∶2 000）及GAPDH（稀釋比為1∶5 000）一抗于4 ℃搖床孵育過夜后用TBST洗膜，加入Alexa Fluor 488標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗室溫孵育2 h。采用ECL化學(xué)發(fā)光法曝光，Image J軟件分析各條帶的灰度值，各條帶的灰度值與內(nèi)參蛋白GAPDH灰度值的比值表示蛋白表達(dá)水平。

2.6 轉(zhuǎn)染NC siRNA或SIRT3 siRNA后心肌成纖維細(xì)胞中SIRT3蛋白表達(dá)水平的檢測

采用Western blot法進(jìn)行檢測。取稀釋過的脂質(zhì)體2000分別和NC siRNA或SIRT3 siRNA（稀釋比均為1∶1 000）混合，加入到心肌成纖維細(xì)胞培養(yǎng)皿中，分為NC siRNA組及SIRT3 siRNA組。待細(xì)胞轉(zhuǎn)染4 h后，棄除轉(zhuǎn)染復(fù)合物，用0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗細(xì)胞后更換成含10%胎牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h后進(jìn)行檢測。每個(gè)樣本平行檢測6次。

2.7 心肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的分組、給藥與造模

心肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染NC siRNA或SIRT3 siRNA后，將細(xì)胞分為NC siRNA組、NC siRNA+Ang Ⅱ組、NC siRNA+Ang Ⅱ+NaHS組或SIRT3 siRNA組、SIRT3 siRNA+Ang Ⅱ組、SIRT3 siRNA+Ang Ⅱ+NaHS組。NC siRNA+Ang Ⅱ+NaHS 組、SIRT3 siRNA+Ang Ⅱ+NaHS組中加入 NaHS 溶液（50 μmol/L）預(yù)處理 4 h，NC siRNA+Ang Ⅱ組、NC siRNA+Ang Ⅱ+NaHS組、SIRT3 siRNA+Ang Ⅱ組、SIRT3 siRNA+Ang Ⅱ+NaHS組中加入Ang Ⅱ溶液（100 nmol/L）刺激細(xì)胞24 h從而誘導(dǎo)產(chǎn)生心肌成纖維細(xì)胞增殖模型，觀察NaHS對心肌成纖維細(xì)胞增殖的影響，每組6個(gè)復(fù)孔。

2.8 心肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染后增殖及羥脯氨酸含量的檢測

細(xì)胞分組和處理同“2.7”項(xiàng)下。按照CCK-8試劑盒、羥脯氨酸測定試劑盒說明書方法進(jìn)行檢測。

2.9 心肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染后Col Ⅰ、Col Ⅲ、OPA1蛋白表達(dá)水平的檢測

采用免疫熒光法進(jìn)行檢測。細(xì)胞分組和處理同“2.7”項(xiàng)下，用PBS清洗細(xì)胞，固定細(xì)胞20 min后棄掉固定液，再用PBS清洗細(xì)胞，封閉細(xì)胞1 h后棄掉封閉液，加入Col Ⅰ、Col Ⅲ、OPA1一抗（稀釋比均為1∶50），4 ℃過夜后用PBS洗滌細(xì)胞，按1∶100的稀釋比加入Alexa Fluor 488標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗（用于Col Ⅰ）和Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗（用于Col Ⅲ、OPA1），室溫避光放置2 h。用DAPI染細(xì)胞核，將載玻片置于熒光顯微鏡上拍片，用Image J軟件測定熒光強(qiáng)度，熒光強(qiáng)弱間接反映Col Ⅰ、Col Ⅲ、OPA1蛋白表達(dá)水平。

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 H2S對Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞增殖和羥脯氨酸含量的影響

與空白組相比，Ang Ⅱ組細(xì)胞OD值和羥脯氨酸含量均顯著升高（P＜0.05）；與Ang Ⅱ組相比，Ang Ⅱ+NaHS組細(xì)胞OD值和羥脯氨酸含量均顯著降低（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，H2S可以顯著抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞增殖，降低羥脯氨酸含量。結(jié)果見圖1。

圖1 H2S對Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞增殖及羥脯氨酸含量的影響（n＝6）

3.2 H2S對Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞中SIRT3蛋白表達(dá)的影響

與空白組相比，Ang Ⅱ組細(xì)胞中SIRT3蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與Ang Ⅱ組相比，Ang Ⅱ+NaHS組細(xì)胞中SIRT3蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，H2S可以顯著提高Ang Ⅱ刺激后心肌成纖維細(xì)胞中SIRT3蛋白表達(dá)。結(jié)果見圖2。

圖2 H2S對Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞中SIRT3蛋白表達(dá)的影響

3.3 轉(zhuǎn)染NC siRNA或SIRT3 siRNA后對心肌成纖維細(xì)胞中SIRT3蛋白表達(dá)的影響

與NC siRNA組相比，SIRT3 siRNA組細(xì)胞中SIRT3蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用干擾RNA技術(shù)成功下調(diào)細(xì)胞中SIRT3蛋白表達(dá)。結(jié)果見圖3。

圖3 轉(zhuǎn)染NC siRNA或SIRT3 siRNA后的心肌成纖維細(xì)胞中SIRT3蛋白表達(dá)水平（n＝6）

3.4 轉(zhuǎn)染SIRT3對H2S抑制心肌成纖維細(xì)胞增殖和降低羥脯氨酸含量的影響

與NC siRNA組相比，NC siRNA+AngⅡ組細(xì)胞OD值及羥脯氨酸含量均顯著升高（P＜0.05）；與NC siRNA+AngⅡ組相比，NC siRNA+Ang Ⅱ+NaHS組細(xì)胞OD值及羥脯氨酸含量均顯著降低（P＜0.05）。下調(diào)SIRT3表達(dá)后，與SIRT3 siRNA組相比，SIRT3 siRNA+Ang Ⅱ組細(xì)胞OD值及羥脯氨酸含量均顯著升高（P＜0.05）；與 SIRT3 siRNA+Ang Ⅱ組相比，SIRT3 siRNA+Ang Ⅱ+NaHS組細(xì)胞OD值及羥脯氨酸含量均無顯著變化（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，H2S依賴SIRT3抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞增殖并且依賴SIRT3降低羥脯氨酸含量。結(jié)果見圖4。

圖4 轉(zhuǎn)染SIRT3對H2S抑制心肌成纖維細(xì)胞增殖和降低羥脯氨酸含量的影響

3.5 轉(zhuǎn)染SIRT3對H2S抑制心肌成纖維細(xì)胞中Col Ⅰ和Col Ⅲ蛋白表達(dá)的影響

如圖5所示，H2S可顯著抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞中Col Ⅰ和Col Ⅲ蛋白表達(dá)升高；而在下調(diào)SIRT3表達(dá)之后，H2S對Col Ⅰ、Col Ⅲ表達(dá)的抑制作用明顯減弱。

圖5 轉(zhuǎn)染SIRT3對H2S抑制心肌成纖維細(xì)胞中Col Ⅰ和Col Ⅲ蛋白表達(dá)的影響（×200）

3.6 轉(zhuǎn)染SIRT3對H2S逆轉(zhuǎn)心肌成纖維細(xì)胞中OPA1蛋白表達(dá)的影響

如圖6所示，H2S能顯著逆轉(zhuǎn)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞中OPA1蛋白表達(dá)降低；而下調(diào)SIRT3表達(dá)之后，H2S的逆轉(zhuǎn)作用被抑制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，H2S對AngⅡ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞中OPA1表達(dá)降低的逆轉(zhuǎn)作用依賴于SIRT3。

圖6 轉(zhuǎn)染SIRT3對H2S增強(qiáng)心肌成纖維細(xì)胞中OPA1蛋白表達(dá)的免疫熒光圖（×200）

4 討論

心肌纖維化是細(xì)胞外基質(zhì)重塑的病理過程，可明顯增加心肌壁僵硬度，惡化心功能，甚至產(chǎn)生心力衰竭以及心源性猝死[9]。心肌纖維化常見于缺血性心臟疾病，包括高血壓[10]、心臟瓣膜病[11]、糖尿病心肌病[12]、肥厚型心肌病和特發(fā)性擴(kuò)張型心肌病[13]等。此外，由于心肌梗死的局部區(qū)域細(xì)胞外基質(zhì)的改變易導(dǎo)致炎癥的產(chǎn)生，因此心肌梗死發(fā)生纖維化的情況最為普遍[9]。

長期以來，H2S被認(rèn)為是一種有毒的氣體。然而，目前越來越多的研究發(fā)現(xiàn)H2S可參與多種纖維化疾病的發(fā)生與發(fā)展。有研究證實(shí)，內(nèi)源性和外源性H2S可以延緩肺、肝臟和腎臟等纖維化進(jìn)展[14]。此外，多種心臟疾病也與H2S的生成紊亂密切相關(guān)，如H2S可抑制慢性心力衰竭機(jī)體心肌纖維化及心肌凋亡，其具體機(jī)制與減少氧化應(yīng)激有關(guān)[15]。最近的研究表明，SIRT3可以通過調(diào)節(jié)靶蛋白的乙?；?，改善線粒體功能，延長機(jī)體壽命[16]；相反，缺乏SIRT3后OPA1減少，心臟損傷加重，機(jī)體壽命顯著縮短[17]。值得注意的是，H2S對多種細(xì)胞具有保護(hù)作用[18]。本實(shí)驗(yàn)以NaHS作為H2S的供體，探討H2S對Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞中SIRT3蛋白表達(dá)的影響。

本實(shí)驗(yàn)通過CCK-8檢測心肌成纖維細(xì)胞增殖發(fā)現(xiàn)，H2S可以顯著抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞增殖。羥脯氨酸是膠原蛋白特有的氨基酸，占氨基酸總量的13%，因此根據(jù)羥脯氨酸含量可以明確膠原水平，而成纖維細(xì)胞是產(chǎn)生膠原的主要細(xì)胞之一，測定羥脯氨酸的含量可間接反映成纖維細(xì)胞增殖情況[19]。通過檢測心肌成纖維細(xì)胞羥脯氨酸含量發(fā)現(xiàn)，H2S可以顯著抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞羥脯氨酸的生成；通過Western blot法檢測SIRT3蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)，H2S可以顯著增強(qiáng)Ang Ⅱ刺激后心肌成纖維細(xì)胞中SIRT3蛋白表達(dá)。下調(diào)SIRT3表達(dá)后，H2S不能抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞增殖及羥脯氨酸的生成。膠原的生成與心肌纖維化密切相關(guān)，SIRT3缺乏會(huì)加重Ang Ⅱ誘導(dǎo)的小鼠心肌成纖維細(xì)胞間質(zhì)纖維化[20]。研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素通過調(diào)節(jié)SIRT3/ROS/MAPK信號通路從而抑制膠原表達(dá)以達(dá)到減少皮膚老化的效果[21]，線粒體融合相關(guān)蛋白OPA1通過促進(jìn)線粒體吞噬來保護(hù)心肌成纖維細(xì)胞[22]。通過免疫熒光檢測心肌成纖維細(xì)胞Col I、Col Ⅲ、OPA1發(fā)現(xiàn)，H2S可以顯著降低Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞的膠原生成，增強(qiáng)心肌成纖維細(xì)胞的OPA1表達(dá)。下調(diào)SIRT3表達(dá)后，H2S降低Col I及Col Ⅲ表達(dá)、增強(qiáng)OPA1表達(dá)的作用明顯減弱。上述結(jié)果表明，H2S可通過上調(diào)SIRT3表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)線粒體融合相關(guān)蛋白OPA1的表達(dá)，改變線粒體的結(jié)構(gòu)和功能，減輕Ang Ⅱ刺激下氧化應(yīng)激，最終抑制心肌成纖維細(xì)胞增殖。

綜上所述，H2S依賴增加SIRT3表達(dá)來抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞增殖。