董 馨 ，王佳琪 ，張秀艷 ，張仲堯 ，陸景坤 ，高建萍 ，薛培鳳 （.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，呼和浩特 000；.呼和浩特市蒙醫(yī)中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，呼和浩特 00000；.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 0000）

骨質(zhì)疏松癥是一種骨代謝性疾病，多發(fā)于老年人與絕經(jīng)后婦女，臨床表現(xiàn)為骨微結(jié)構(gòu)退化和骨密度降低，進(jìn)而增加骨脆性，誘發(fā)骨骼變形、骨折、骨骼疼痛以及多臟器損傷等并發(fā)癥[1]。而隨著人口老齡化加劇，骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率已居慢性病第三位[2]。據(jù)相關(guān)調(diào)查顯示，我國(guó)60歲以上人群骨質(zhì)疏松癥患病率達(dá)到36.0%，預(yù)計(jì)至2050年，我國(guó)骨質(zhì)疏松癥患者將達(dá)到2.02億人[3]。而現(xiàn)有的骨質(zhì)疏松癥治療藥物存在副作用大、價(jià)格昂貴、患者依從性差等問(wèn)題[4]。因此，積極開(kāi)展對(duì)老年性骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防與治療，研發(fā)安全、有效、經(jīng)濟(jì)的抗骨質(zhì)疏松新藥意義重大。

蒙藥藍(lán)刺頭Echinops sphaerocephalus Linn.為菊科多年生草本植物，具有接骨愈傷、壯骨之功效[5]。本課題組前期已對(duì)藍(lán)刺頭中化學(xué)成分及其對(duì)去勢(shì)大鼠骨代謝、細(xì)胞因子的調(diào)控作用進(jìn)行了初步研究，證實(shí)了藍(lán)刺頭提取物具有類(lèi)雌激素樣作用，能夠有效防治絕經(jīng)后期骨質(zhì)疏松癥[6―7]。但目前有關(guān)藍(lán)刺頭對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥是否有效，且如何起效尚不明確。本研究通過(guò)經(jīng)典藥理學(xué)指標(biāo)研究藍(lán)刺頭對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥模型大鼠的療效；同時(shí)借助代謝組學(xué)技術(shù)優(yōu)勢(shì)，探究大鼠的代謝變化，并通過(guò)差異代謝物與代謝通路分析探討其代謝機(jī)制，以期為藍(lán)刺頭防治骨質(zhì)疏松癥提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有Q-ExactiveTM組合型四極桿OrbitrapTM質(zhì)譜儀、Ultimate 3000型高效液相色譜系統(tǒng)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司），Milli-Q iq7000型超純水系統(tǒng)（德國(guó)Merk公司），5424R型離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司），EYELAN-1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海愛(ài)朗儀器有限公司），F(xiàn)orma 900 Series型超低溫冰箱（美國(guó)Thermo Scientific公司），Inveon MM型小動(dòng)物正電子發(fā)射斷層顯像/X線(xiàn)計(jì)算機(jī)體層成像儀（positron emission tomography/computedtomography，PET/CT；德國(guó)Siemens公司），Spectra Max i3x型酶標(biāo)儀[美谷分子儀器（上海）有限公司]。

1.2 主要藥品與試劑

丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、羥脯氨酸（hydroxyproline，HYP）、總抗氧化能力（total antioxidant capacity，TAOC）檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為ab119611、ab65445、GR201812-1、GR201833-3、ab118194；生理鹽水（批號(hào)210803）、D-半乳糖（批號(hào)CG29133740）均購(gòu)自呼和浩特市澤浩生物科技有限責(zé)任公司；骨疏康顆粒（陽(yáng)性對(duì)照藥，批號(hào)151002332，每袋裝10 g）購(gòu)自遼寧沃華康辰藥業(yè)有限公司；液質(zhì)聯(lián)用級(jí)乙腈、甲酸均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。藍(lán)刺頭藥材于2020年8月采集自?xún)?nèi)蒙古武川縣，經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室渠弼副教授鑒定為真品。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性Wistar大鼠36只，體質(zhì)量（200±20）g，12周齡，購(gòu)自?xún)?nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（蒙）2015-0001。大鼠飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)受控環(huán)境（相對(duì)濕度50%～60%，溫度18～22 ℃，12 h晝夜交替，自由進(jìn)食飲水）。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)為YKD2018056）。所有大鼠飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2 方法

2.1 藥液的制備

取500 g 藍(lán)刺頭藥材，加入6 000 mL蒸餾水，加熱回流提取2次，每次30 min。將2次濾液合并，濃縮、凍干后得藍(lán)刺頭提取物凍干粉，經(jīng)紫外分光光度法[8]測(cè)得其總酚酸含量為63.03 mg/g，于－20 ℃保存?zhèn)溆?。使用時(shí)加入適量蒸餾水溶解得質(zhì)量濃度為21 mg/mL的藍(lán)刺頭凍干粉藥液（以藍(lán)刺頭提取物計(jì)）；同時(shí)使用適量蒸餾水溶解骨疏康顆粒，得質(zhì)量濃度為10.5 mg/mL的藥液。

2.2 動(dòng)物分組、造模與給藥

采用數(shù)字隨機(jī)分組法將36只大鼠分為6組，分別為空白組、模型組、骨疏康組和藍(lán)刺頭高、中、低劑量組，每組6只。空白組按5 mL/kg腹腔注射生理鹽水，其余各組按120 mg/kg腹腔注射D-半乳糖，持續(xù)注射8周，建立骨質(zhì)疏松癥模型[9]。建模后，藍(lán)刺頭高、中、低劑量組分別按878、439、219.5 mg/kg（分別為臨床等效劑量的4、2、1倍）灌胃藍(lán)刺頭凍干粉藥液；骨疏康組按105.1 mg/kg（劑量為臨床等效劑量）灌胃骨疏康藥液；空白組與模型組灌胃等體積生理鹽水。每日1次，連續(xù)給藥8周。

2.3 取材

各組大鼠末次給藥后，連續(xù)12 h禁食不禁水，然后麻醉，腹主動(dòng)脈取血，置于5 mL采血管中，3 500 r/min離心10 min后分離血清，置于－80 ℃保存?zhèn)溆谩⒋笫笕⊙筇幩?，取右?cè)脛骨，剔除肌肉，用生理鹽水沖洗干凈，以保鮮膜和錫紙包裹后，分裝在密封袋中并標(biāo)記，置于－80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 血清中骨代謝與氧化應(yīng)激指標(biāo)含量的檢測(cè)

采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血清中骨代謝指標(biāo)（HYP、ALP）及氧化應(yīng)激指標(biāo)（TAOC、SOD、MDA）的含量。

2.5 骨微結(jié)構(gòu)的檢測(cè)

采用PET/CT掃描各組大鼠右側(cè)脛骨，并使用micro-CT骨分析軟件進(jìn)行分析，評(píng)價(jià)各組大鼠右側(cè)脛骨密度（bone mineral density，BMD）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb·Th）、骨小梁數(shù)量（trabecular number，Tb·N）、骨小梁間距（trabecular separation，Tb·Sp）。同時(shí)在感興趣區(qū)域圖像中測(cè)量脛骨中軸處皮質(zhì)骨的骨體積分?jǐn)?shù)（bone volume fraction，BVF）、骨表面積/骨體積比值（bone surface/bone volume，BS/BV）。

2.6 代謝組學(xué)研究

2.6.1 溶液的制備 （1）樣本溶液：取出凍存的各組大鼠血清，于4 ℃下解凍。取200 μL血清樣品，采用3倍體積甲醇進(jìn)行蛋白沉淀。將血清與甲醇混合物渦旋5 min，于4 ℃下14 000 r/min離心10 min；隨后取上清液，減壓離心、濃縮干燥后，用100 μL甲醇復(fù)溶，渦旋5 min，14 000 r/min離心10 min，取上清液置于進(jìn)樣瓶中備用。（2）質(zhì)量控制（quality control，QC）樣本溶液：另分別吸取所有血清樣本各10 μL混合為QC樣本，處理方法同“2.6.1（1）”項(xiàng)下，取上清液置于進(jìn)樣瓶中備用。

2.6.2 色譜條件與質(zhì)譜條件 （1）色譜條件：以Thermo Hypersil PFP（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）為色譜柱進(jìn)行分離，以0.1%甲酸溶液（A）-乙腈（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0～1 min，2%B→5%B；1～10 min，5%B→46%B；10～20 min，46%B→80%B；20～35 min，80%B→100%B）；柱溫為35 ℃，進(jìn)樣量為5 μL，流速為0.3 mL/min。（2）質(zhì)譜方法：采用電噴霧電離源，在full ms/dd ms2模式下進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。具體采集參數(shù)設(shè)置噴霧電壓為3.5 V（+）/2.8 V（－），毛細(xì)管溫度為400 °C（+）/350 °C（－），鞘氣（N2）流速為40 psi（+）/35 psi（－），輔助氣體（N2）流速為5 psi，S-lens RF水平為50.0，一級(jí)質(zhì)譜掃描范圍為m/z 100～1 100，二級(jí)質(zhì)譜掃描范圍為m/z 50～750。

2.6.3 分析方法穩(wěn)定性與精密度考察 在樣本分析過(guò)程中插入QC樣本溶液進(jìn)行分析，以QC樣本溶液中在正、負(fù)離子模式下6個(gè)隨機(jī)化合物保留時(shí)間和峰面積的RSD為指標(biāo)評(píng)價(jià)分析方法的穩(wěn)定性與精密度。

2.6.4 數(shù)據(jù)處理 液質(zhì)聯(lián)用儀采集的原始數(shù)據(jù)文件通過(guò)Discoverer Compound（CD）TM2.0軟件進(jìn)行峰識(shí)別、峰篩選、峰提出以及峰面積的自動(dòng)計(jì)算，最終形成兼具化合物名稱(chēng)、保留時(shí)間、分子量、分子式、峰面積、mzCloud等信息的多維峰表。將上述峰表導(dǎo)入SIMCA-P 14.1軟件進(jìn)行正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA），以變量投影重要性（variable importance in the project，VIP）值＞1且P＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)，篩選各組間差異代謝物。同時(shí)借助PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、人類(lèi)代謝組數(shù)據(jù)庫(kù)（HMDB）（http：//www.hmdb.ca/）以及化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)上述差異代謝物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。最終采用Metabo-Analyst（http：//www.metaboanalyst.ca/）進(jìn)行生物代謝通路分析?；谕犯患治龊屯吠?fù)浞治?，以－lg（P）值＞2和通路影響閾值＞0.05為標(biāo)準(zhǔn)，確定藍(lán)刺頭主要影響的代謝通路。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件對(duì)組間的差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠血清中骨代謝及氧化應(yīng)激指標(biāo)含量的比較

與空白組相比，模型組大鼠血清中HYP、ALP、MDA含量均顯著升高（P＜0.05），TAOC與SOD含量均顯著降低（P＜0.05）。相較于模型組，給予高、中、低劑量的藍(lán)刺頭凍干粉藥液及骨疏康藥液可顯著降低大鼠血清中HYP、ALP（藍(lán)刺頭低劑量組除外）、MDA含量（P＜0.05），顯著升高大鼠血清中TAOC（藍(lán)刺頭低劑量組除外）、SOD含量（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠骨代謝及氧化應(yīng)激血清指標(biāo)比較（n＝6）

3.2 各組大鼠骨微結(jié)構(gòu)變化比較

與空白組相比，模型組大鼠BS/BV、Tb·Sp水平均顯著升高（P＜0.05），BMD、BVF、Tb·Th、Tb·N水平均顯著降低（P＜0.05）。相較于模型組，給予高、中、低劑量的藍(lán)刺頭凍干粉藥液及骨疏康藥液可顯著降低大鼠BS/BV、Tb·Sp水平（P＜0.05），顯著升高BMD、BVF、Tb·Th（骨疏康組除外）、Tb·N水平（P＜0.05）。PET/CT結(jié)果顯示，空白組大鼠脛骨內(nèi)的骨小梁排列緊密、整齊，骨結(jié)構(gòu)完整；模型組大鼠骨小梁間隙大，出現(xiàn)多處無(wú)骨連接的空洞。與模型組相比，骨疏康組和藍(lán)刺頭低、中、高劑量組大鼠的骨微結(jié)構(gòu)得到明顯改善，骨小梁結(jié)構(gòu)緊湊，無(wú)骨連接的空洞得到修復(fù)。結(jié)果見(jiàn)圖2、圖3。

圖2 各組大鼠骨微結(jié)構(gòu)指標(biāo)比較（n＝6）

圖3 各組大鼠脛骨micro-CT圖

3.3 代謝組學(xué)分析結(jié)果

3.3.1 分析方法穩(wěn)定性考察結(jié)果 如圖4A中QC樣本聚類(lèi)良好，結(jié)果顯示，6個(gè)化合物保留時(shí)間RSD為0.08%～0.77%、峰面積RSD為0.15%～1.12%，均小于2%，提示分析方法穩(wěn)定性與精密度良好。

3.3.2 血清代謝輪廓分析 本研究采用OPLS-DA對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，揭示組間差異及代謝輪廓。考慮藥效與劑量?jī)煞矫?，由于藍(lán)刺頭低劑量有部分藥效指標(biāo)與模型組沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而藍(lán)刺頭高劑量是臨床等效劑量4倍，劑量過(guò)高與臨床研究不完全切合，因此折中選擇藍(lán)刺頭中劑量進(jìn)行比較。由各模式下得分圖（圖4A～C）可知，模型組與空白組可明顯區(qū)分，表明兩組間代謝物存在差異；藍(lán)刺頭中劑量組空間分布于二者之間，提示藥物具有逆轉(zhuǎn)D-半乳糖誘導(dǎo)損傷的作用。模型預(yù)測(cè)圖（圖略）顯示，模型參數(shù)R2、Q2值分別不低于0.749、－0.298，且Q2值始終低于R2。此外，Q2回歸線(xiàn)的截距小于0，提示該OPLS-DA模型未過(guò)度擬合，對(duì)樣本預(yù)測(cè)能力良好[10]。

圖4 不同組別OPLS-DA得分圖

3.3.3 差異代謝物篩選與鑒定 結(jié)合上述OPLS-DA結(jié)果，以VIP值＞1且P＜0.05為篩選條件獲得組間差異代謝物。并將差異代謝物峰的色譜信息與數(shù)據(jù)庫(kù)、化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)，推測(cè)并鑒定差異代謝物的結(jié)構(gòu)。最終獲得藍(lán)刺頭用藥后，大鼠血清中花生四烯酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、異亮氨酸、尿酸等18種代謝物發(fā)生顯著變化，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 藍(lán)刺頭治療D-半乳糖誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松的差異代謝物

3.3.4 代謝通路分析的結(jié)果 MetaboAnalyst通路分析結(jié)果顯示，藍(lán)刺頭用藥后共干預(yù)15條代謝通路，包括花生四烯酸代謝、苯丙氨酸代謝、酪氨酸代謝等。藍(lán)刺頭治療骨質(zhì)疏松癥主要影響的代謝通路具體包括花生四烯酸代謝[－lg（P）＝4.937，P＝0.007 2]、苯丙氨酸代謝[－lg（P）＝3.360，P＝0.034 7]和酪氨酸代謝[－lg（P）＝2.421 8，P＝0.028 7]。結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 藍(lán)刺頭提取物干預(yù)骨質(zhì)疏松癥的代謝通路分析

4 討論

老年性骨質(zhì)疏松癥病因包括氧化應(yīng)激損傷、維生素D缺乏、激素變化、缺乏運(yùn)動(dòng)的生活方式等。本研究選用D-半乳糖作為衰老誘導(dǎo)劑，通過(guò)氧化應(yīng)激損傷誘發(fā)骨質(zhì)疏松癥，是多數(shù)老年性骨質(zhì)疏松癥的造模方法[11]。為明確模型大鼠細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷程度與衰老情況，采用MDA、SOD、TAOC為檢測(cè)指標(biāo)。相關(guān)研究表明，MDA含量反映了體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的速度[12]；血清中的SOD和TAOC含量反映機(jī)體抗氧化能力[13―14]。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組血清中MDA含量較空白組顯著升高，TAOC與SOD含量則較空白組顯著降低，提示D-半乳糖誘導(dǎo)確能激活細(xì)胞氧化反應(yīng)。而采用藍(lán)刺頭凍干粉藥液干預(yù)后，模型大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激指標(biāo)明顯得到改善，說(shuō)明藍(lán)刺頭具有一定抗氧化作用。

為進(jìn)一步探究D-半乳糖誘導(dǎo)對(duì)大鼠骨代謝水平與骨微結(jié)構(gòu)的影響，本研究檢測(cè)了大鼠血清中ALP、HYP含量，并借助PET/CT檢測(cè)不同組別大鼠骨微結(jié)構(gòu)變化。ALP與HYP是反映骨形成和骨吸收平衡的重要標(biāo)志物，若兩者含量升高，說(shuō)明骨吸收大于骨形成，則易誘發(fā)骨質(zhì)疏松[15]。本次研究結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)，模型組大鼠體內(nèi)ALP與HYP含量均顯著高于空白組，說(shuō)明模型組大鼠體內(nèi)骨吸收速率快。此外，PET/CT檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組大鼠骨微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)一定程度惡化，如 Tb·Sp、BS/BV 均顯著升高，BMD、BVF、Tb·Th、Tb·N均顯著降低，進(jìn)一步證實(shí)了骨質(zhì)疏松癥的形成。而藍(lán)刺頭凍干粉藥液的干預(yù)則有利于上述不良情況的逆轉(zhuǎn)，如給藥后血清中ALP（藍(lán)刺頭低劑量組除外）、HYP含量和Tb·Sp、BS/BV均顯著降低，BMD、BVF、Tb·Th、Tb·N均顯著升高。這均是藍(lán)刺頭可以改善D-半乳糖誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥臨床癥狀的有力證據(jù)。

此外，代謝組學(xué)研究結(jié)果顯示，藍(lán)刺頭通過(guò)花生四烯酸、苯丙氨酸、二十二碳六烯酸等代謝物，進(jìn)而調(diào)控花生四烯酸代謝、苯丙氨酸代謝等通路，發(fā)揮治療D-半乳糖誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥作用。據(jù)相關(guān)研究報(bào)道，花生四烯酸與二十二碳六烯酸可破壞骨轉(zhuǎn)化平衡，降低BMD；在骨質(zhì)疏松病理狀態(tài)下，花生四烯酸和二十二碳六烯酸水平較高[16]。本次研究結(jié)果也具有以上趨勢(shì)，給予藍(lán)刺頭凍干粉藥液后，以上代謝物水平得以下調(diào)，說(shuō)明藍(lán)刺頭可通過(guò)降低體內(nèi)花生四烯酸和二十二碳六烯酸水平，進(jìn)而抑制骨轉(zhuǎn)化平衡的破壞進(jìn)程，維持骨骼組織內(nèi)部穩(wěn)態(tài)。苯丙氨酸和酪氨酸代謝是骨組織退化的另一個(gè)重要代謝途徑[17]。苯丙氨酸可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，且參與老年退行性疾病的病理進(jìn)展過(guò)程[18]。本研究中D-半乳糖正是誘導(dǎo)機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)的原因，模型組大鼠體內(nèi)苯丙氨酸和酪氨酸含量較空白組顯著升高，提示D-半乳糖誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松大鼠存在苯丙氨酸代謝紊亂。藍(lán)刺頭能夠有效降低大鼠體內(nèi)苯丙氨酸和酪氨酸水平，進(jìn)而改善D-半乳糖誘導(dǎo)的苯丙氨酸和酪氨酸代謝紊亂。其他氨基酸，如色氨酸、異亮氨酸等，是蛋白質(zhì)的基本組成部分，也是生命活動(dòng)的重要物質(zhì)。以往研究表明，機(jī)體長(zhǎng)期缺乏色氨酸會(huì)導(dǎo)致血清素合成減少，進(jìn)而導(dǎo)致BMD降低[19]。因此，本研究中色氨酸、異亮氨酸等的變化同樣預(yù)示著D-半乳糖誘導(dǎo)后的骨代謝異常。藍(lán)刺頭則可通過(guò)改善色氨酸、異亮氨酸等代謝紊亂，從而抑制骨質(zhì)疏松癥的發(fā)展。

綜上所述，藍(lán)刺頭提取物能夠有效改善D-半乳糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)及骨微結(jié)構(gòu)惡化，并通過(guò)干預(yù)花生四烯酸代謝、氨基酸代謝等途徑起效。