姜韜,馬麗園,邢林帥,趙立鵬,葉子琪,馬碩,師新榮 .寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院結(jié)直腸外科,寧夏 銀川 750004;.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院超聲科,寧夏 銀川 750004;.寧夏醫(yī)科大學(xué)研究生院,寧夏 銀川 750004
世界范圍內(nèi),結(jié)腸癌是發(fā)病率排序第三的惡性腫瘤,復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致根治術(shù)后生存率降低的主要因素,鑒定新型治療靶標(biāo)對結(jié)腸癌個體化治療及預(yù)后具有重要意義[1-3]。同源異形盒基因A1 (homeobox A1,HOXA1)屬于HOX 轉(zhuǎn)錄因子家族,位于人染色體7p15.2基因編碼區(qū),是細(xì)胞分化、DNA修復(fù)、細(xì)胞凋亡等生物學(xué)行為的關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因,其表達(dá)異常會引起個體發(fā)育和組織器官形成過程中出現(xiàn)異常形態(tài)結(jié)構(gòu),與肺癌、黑色素瘤、胰腺癌等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4-5]。目前HOXA1 與結(jié)腸癌的關(guān)系尚未見報道。本研究旨在明確HOXA1 在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)情況,探討其在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的臨床意義。
1.1 一般材料 (1)結(jié)腸癌新鮮冰凍組織:隨機(jī)選取2021 年3~10月寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院結(jié)直腸外科手術(shù)切除結(jié)腸癌樣本66 例,其中右半結(jié)腸41 例,左半結(jié)腸25例。同時取距癌灶邊緣最遠(yuǎn)處(至少>5 cm)正常結(jié)腸組織作為對照。取材后將標(biāo)本凍存管立即置于液氮中,登記信息并最終保存于-86℃低溫冰箱中。所有樣本病理最終確診為結(jié)腸腺癌,術(shù)前均未行新輔助化療。66例患者中Ⅰ期2例,Ⅱ期27例,Ⅲ期34例,Ⅳ期3例。(2)結(jié)腸癌石蠟組織芯片(tissue microarray,TMA):由課題組構(gòu)建完成,所有結(jié)腸癌組織及配對正常結(jié)腸組織均取自于寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院結(jié)直腸外科手術(shù)病例標(biāo)本庫,一套組織芯片共13 張,由203 例結(jié)腸癌+結(jié)腸正常組織構(gòu)成。其中男性110 例,女性93 例;年齡21~88 歲,中位平均63.5 歲;AJCC 分期:Ⅰ期24例,Ⅱ期81例,Ⅲ期80例,Ⅳ期18例(均存在遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移)。組織學(xué)分型:高分化腺癌100 例,中分化腺癌35 例,低分化腺癌68 例。所有病例資料TNM分期參照結(jié)直腸癌(National Comprehensive Cancer Network,NCCN)指南[6]。本研究獲得寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院倫理學(xué)會批準(zhǔn),患者及家屬對本研究知情并簽署相關(guān)知情同意文件。
1.2 試劑與方法
1.2.1 試劑 RT-qPCR 引物由上海生工公司合成,RNeasy protect Mini kit(Qiagen,德國),反轉(zhuǎn)錄RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific,美國),PCR 試劑盒SYBR Green qPCR Master Mixes (Thermo Scientific,美國),Anti-HOXA1 抗體(ab230513,Abcam),免疫組化EnVisionTMDetection Kit (Dako,丹麥),辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(Beyotime,中國)。
1.2.2 方法 (1)RT-qPCR:組織RNA提取參照試劑盒說明,紫外分光光度計檢測260 nm和280 nm處的吸光度值,檢測RNA的純度。通過反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以O(shè)ligo(dT)15為引物,由Total RNA的3’Poly(A)區(qū)域引導(dǎo)出cDNA,以cDNA 產(chǎn)物為模板,設(shè)計合成PCR 引物:HOXA1 Forward primer:5'-CGGCTTCCTGTGCTAAGTCT-3',Reverse primer:5'-TTCATTGTGCCATCCATCAC-3'。β-actin Forward primer:5'-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3',Reverse primer:5'-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3'。采用SYBR Green 熒光染料在Eppendoff 高通量熒光定量PCR 儀中進(jìn)行。每份標(biāo)本設(shè)3 個平行對照反應(yīng)孔,反應(yīng)條件:50℃2 min,95℃10 min,95℃20 s,60℃30 s,70℃30 s,共40 個循環(huán),反應(yīng)結(jié)束后自動分析熒光信號并轉(zhuǎn)換為起始拷貝數(shù)及循環(huán)閾值(Ct)。以2-△△Ct值為mRNA 相對表達(dá)量。(2)免疫組織化學(xué):將結(jié)腸癌組織芯片(4 μm)分別于二甲苯中脫蠟,梯度乙醇中水化。檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)中行高壓抗原熱修復(fù),3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶10 min。PBS洗5 min×3 次后,滴加用一抗:(Anti-HOXA1 antibody,1∶200)50 μL,4℃孵育過夜。室溫復(fù)溫后滴加EnVision?Detection Kit,Peroxidase/DAB,Rabbit/Mouse(鼠/兔通用型)二抗200 μL,室溫孵育30 min。顯微鏡下DAB(二氨基聯(lián)苯胺)顯色,蘇木素復(fù)染、鹽酸乙醇化、脫水并中性樹膠封片。用已知結(jié)腸癌切片作為陽性對照,PBS代替一抗為陰性對照。結(jié)果判讀:細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽性。根據(jù)染色的范圍和強(qiáng)度之和進(jìn)行評分:染色范圍:0分,0%;1分,1%~25%;2分,26%~50%;3分,>50%。染色強(qiáng)度:0分,未染色;1分,淡黃色;2分,棕黃色;3分,棕褐色。最終結(jié)果:0~2分,陰性;3~4分,弱陽性;5~6分,強(qiáng)陽性[7]。
1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS25.0 統(tǒng)計軟件分析所有數(shù)據(jù)。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 RNA 質(zhì)量控制 所有樣本的RNA 在A260/A280的比值均在1.8~2.0,結(jié)果顯示所提取的RNA無蛋白質(zhì)污染,無降解,可用于RT-qPCR檢測。
2.2 66 對結(jié)腸癌新鮮冰凍樣本HOXA1 mRNA的表達(dá)水平 RT-qPCR檢測結(jié)果顯示,結(jié)腸癌組織中HOXA1 mRNA 的相對表達(dá)量為5.634±0.563,明顯高于正常結(jié)腸組織的1.893±0.442,差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),見圖1。
圖1 RT-qPCR檢測66對樣本HOXA1 mRNA的表達(dá)水平Figure 1 RT-qPCR analysis of HOXA1 mRNA expression in 66 paired specimens of colon cancer tissues and normal tissues
2.3 結(jié)腸癌及配對正常組織中HOXA1蛋白的表達(dá)水平比較 203例結(jié)腸癌組織芯片進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測,結(jié)果顯示,HOXA1 蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞核中,其在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)陽性率高于正常結(jié)腸組織,差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),見表1和圖2。
圖2 結(jié)腸癌及配對正常組織中HOXA1蛋白的表達(dá)水平(DAB染色×10)Figure 2 Expression of HOXA1 protein in colon cancer tissue and corresponding normal tissues(DAB staining×10)
表1 結(jié)腸癌及配對正常組織中HOXA1蛋白的表達(dá)水平比較[例(%)]Table 1 Comparison of HOXA1 expression level in human colon cancer tissue and corresponding normal tissue[n(%)]
2.4 HOXA1 表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)系 結(jié)腸癌組織中,HOXA1 的表達(dá)水平與患者年齡、性別及腫瘤位置無顯著相關(guān)性(P>0.05);HOXA1 表達(dá)水平與AJCC 分期、腫瘤浸潤深度(T 分期)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及組織學(xué)分型相關(guān)(P<0.05),見表2。HOXA1 表達(dá)越強(qiáng),患者AJCC 分期越晚,具備組織學(xué)分型差的高危因素。
表2 203例結(jié)腸癌中HOXA1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系(例)Table 2 The relationship between HOXA1 expression and clinicopathological characteristics in 203 cases of colon cancer(n)
結(jié)腸癌是常見的消化道惡性腫瘤,其發(fā)生發(fā)展是由遺傳物質(zhì)改變和外部環(huán)境相互綜合作用長期演變的結(jié)果。目前針對結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制尚未完全闡明,但與之相關(guān)的新型分子生物標(biāo)志物篩選為其提供了新的治療方向[8]。同源異形盒基因A1(HOXA1)作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因參與了腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。血管新生是惡性腫瘤重要的生物學(xué)特征,HOX基因家族成員在血管新生中具備正向調(diào)控及反向調(diào)控的作用。例如:HOXA3 可通過上調(diào)ICAM1、MMP14 等基因的表達(dá)促進(jìn)血管新生,而HOXA5、HOXB13 則通過下調(diào)VEGFR2、HIF1α、ephrin A1等血管生成基因的表達(dá)發(fā)揮抑制血管新生的作用[9]。文獻(xiàn)報道HOXA1的異常高表達(dá)可以促進(jìn)肺癌、黑色素瘤、胰腺癌等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[10-11]。HOXA1 廣泛存在于乳腺上皮細(xì)胞,其異常高表達(dá)能夠促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化,進(jìn)而調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生發(fā)展[12-14]。在乳腺癌中,RBCK1/HOIL-1 以及TRAF2 是HOXA1 的下游特異性靶點。HOXA1通過與TRAF2啟動子序列結(jié)合直接激活TRAF2,進(jìn)而活化IκB激酶(IKK)并磷酸化降解IκBα,激活NF-κB信號通路,最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖活性增加、凋亡減少等惡性生物學(xué)行為改變[15-16]。
本研究應(yīng)用結(jié)腸癌新鮮冰凍樣本檢測HOXA1 mRNA 的表達(dá)情況,結(jié)果顯示HOXA1 在結(jié)腸癌組織中的mRNA表達(dá)水平顯著高于正常結(jié)腸組織。203例結(jié)腸癌石蠟樣本中進(jìn)一步免疫組化結(jié)果顯示,62.56%的結(jié)腸癌組織中高表達(dá)HOXA1,顯著高于對照組,此結(jié)果與轉(zhuǎn)錄水平檢測結(jié)果一致。結(jié)腸癌中HOXA1的高表達(dá)與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及組織學(xué)分型相關(guān),而與年齡,性別及腫瘤位置無顯著相關(guān)。HOXA1 高表達(dá)的患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為85.71%,而陰性表達(dá)的患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率僅為14.28%。HOXA1 在Ⅲ~Ⅳ期結(jié)腸癌患者中的高表達(dá)比例顯著高于Ⅰ~Ⅱ期結(jié)腸癌的患者(82.65%vs 43.81%)。上述結(jié)果提示高表達(dá)HOXA1的結(jié)腸癌患者具備預(yù)后不良的高危因素。
綜上所述,HOXA1 異常高表達(dá)在結(jié)腸癌進(jìn)展過程中起到重要的作用,HOXA1 異常高表達(dá)的結(jié)腸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高,臨床分期晚,提示此類患者預(yù)后不良,HOXA1 可能為判斷結(jié)腸癌預(yù)后的新型分子標(biāo)志物。但是HOXA1促進(jìn)結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)機(jī)制尚未明確,需要進(jìn)一步研究探討。