姜韜，馬麗園，邢林帥，趙立鵬，葉子琪，馬碩，師新榮 .寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院結(jié)直腸外科，寧夏 銀川 750004；.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院超聲科，寧夏 銀川 750004；.寧夏醫(yī)科大學(xué)研究生院，寧夏 銀川 750004

世界范圍內(nèi)，結(jié)腸癌是發(fā)病率排序第三的惡性腫瘤，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致根治術(shù)后生存率降低的主要因素，鑒定新型治療靶標(biāo)對結(jié)腸癌個體化治療及預(yù)后具有重要意義[1-3]。同源異形盒基因A1 (homeobox A1，HOXA1)屬于HOX 轉(zhuǎn)錄因子家族，位于人染色體7p15.2基因編碼區(qū)，是細(xì)胞分化、DNA修復(fù)、細(xì)胞凋亡等生物學(xué)行為的關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因，其表達(dá)異常會引起個體發(fā)育和組織器官形成過程中出現(xiàn)異常形態(tài)結(jié)構(gòu)，與肺癌、黑色素瘤、胰腺癌等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4-5]。目前HOXA1 與結(jié)腸癌的關(guān)系尚未見報道。本研究旨在明確HOXA1 在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)情況，探討其在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 一般材料 (1)結(jié)腸癌新鮮冰凍組織：隨機選取2021 年3～10月寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院結(jié)直腸外科手術(shù)切除結(jié)腸癌樣本66 例，其中右半結(jié)腸41 例，左半結(jié)腸25例。同時取距癌灶邊緣最遠(yuǎn)處(至少＞5 cm)正常結(jié)腸組織作為對照。取材后將標(biāo)本凍存管立即置于液氮中，登記信息并最終保存于-86℃低溫冰箱中。所有樣本病理最終確診為結(jié)腸腺癌，術(shù)前均未行新輔助化療。66例患者中Ⅰ期2例，Ⅱ期27例，Ⅲ期34例，Ⅳ期3例。(2)結(jié)腸癌石蠟組織芯片(tissue microarray，TMA)：由課題組構(gòu)建完成，所有結(jié)腸癌組織及配對正常結(jié)腸組織均取自于寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院結(jié)直腸外科手術(shù)病例標(biāo)本庫，一套組織芯片共13 張，由203 例結(jié)腸癌+結(jié)腸正常組織構(gòu)成。其中男性110 例，女性93 例；年齡21～88 歲，中位平均63.5 歲；AJCC 分期：Ⅰ期24例，Ⅱ期81例，Ⅲ期80例，Ⅳ期18例(均存在遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移)。組織學(xué)分型：高分化腺癌100 例，中分化腺癌35 例，低分化腺癌68 例。所有病例資料TNM分期參照結(jié)直腸癌(National Comprehensive Cancer Network，NCCN)指南[6]。本研究獲得寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院倫理學(xué)會批準(zhǔn)，患者及家屬對本研究知情并簽署相關(guān)知情同意文件。

1.2 試劑與方法

1.2.1 試劑 RT-qPCR 引物由上海生工公司合成，RNeasy protect Mini kit(Qiagen，德國)，反轉(zhuǎn)錄RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific，美國)，PCR 試劑盒SYBR Green qPCR Master Mixes (Thermo Scientific，美國)，Anti-HOXA1 抗體(ab230513，Abcam)，免疫組化EnVisionTMDetection Kit (Dako，丹麥)，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(Beyotime，中國)。

1.2.2 方法 (1)RT-qPCR：組織RNA提取參照試劑盒說明，紫外分光光度計檢測260 nm和280 nm處的吸光度值，檢測RNA的純度。通過反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以O(shè)ligo(dT)15為引物，由Total RNA的3’Poly(A)區(qū)域引導(dǎo)出cDNA，以cDNA 產(chǎn)物為模板，設(shè)計合成PCR 引物：HOXA1 Forward primer：5'-CGGCTTCCTGTGCTAAGTCT-3'，Reverse primer：5'-TTCATTGTGCCATCCATCAC-3'。β-actin Forward primer：5'-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3'，Reverse primer：5'-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3'。采用SYBR Green 熒光染料在Eppendoff 高通量熒光定量PCR 儀中進行。每份標(biāo)本設(shè)3 個平行對照反應(yīng)孔，反應(yīng)條件：50℃2 min，95℃10 min，95℃20 s，60℃30 s，70℃30 s，共40 個循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后自動分析熒光信號并轉(zhuǎn)換為起始拷貝數(shù)及循環(huán)閾值(Ct)。以2-△△Ct值為mRNA 相對表達(dá)量。(2)免疫組織化學(xué)：將結(jié)腸癌組織芯片(4 μm)分別于二甲苯中脫蠟，梯度乙醇中水化。檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)中行高壓抗原熱修復(fù)，3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶10 min。PBS洗5 min×3 次后，滴加用一抗：(Anti-HOXA1 antibody，1∶200)50 μL，4℃孵育過夜。室溫復(fù)溫后滴加EnVision?Detection Kit，Peroxidase/DAB，Rabbit/Mouse(鼠/兔通用型)二抗200 μL，室溫孵育30 min。顯微鏡下DAB(二氨基聯(lián)苯胺)顯色，蘇木素復(fù)染、鹽酸乙醇化、脫水并中性樹膠封片。用已知結(jié)腸癌切片作為陽性對照，PBS代替一抗為陰性對照。結(jié)果判讀：細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽性。根據(jù)染色的范圍和強度之和進行評分：染色范圍：0分，0%；1分，1%～25%；2分，26%～50%；3分，＞50%。染色強度：0分，未染色；1分，淡黃色；2分，棕黃色；3分，棕褐色。最終結(jié)果：0～2分，陰性；3～4分，弱陽性；5～6分，強陽性[7]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS25.0 統(tǒng)計軟件分析所有數(shù)據(jù)。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RNA 質(zhì)量控制 所有樣本的RNA 在A260/A280的比值均在1.8～2.0，結(jié)果顯示所提取的RNA無蛋白質(zhì)污染，無降解，可用于RT-qPCR檢測。

2.2 66 對結(jié)腸癌新鮮冰凍樣本HOXA1 mRNA的表達(dá)水平 RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中HOXA1 mRNA 的相對表達(dá)量為5.634±0.563，明顯高于正常結(jié)腸組織的1.893±0.442，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，見圖1。

圖1 RT-qPCR檢測66對樣本HOXA1 mRNA的表達(dá)水平Figure 1 RT-qPCR analysis of HOXA1 mRNA expression in 66 paired specimens of colon cancer tissues and normal tissues

2.3 結(jié)腸癌及配對正常組織中HOXA1蛋白的表達(dá)水平比較 203例結(jié)腸癌組織芯片進行免疫組織化學(xué)檢測，結(jié)果顯示，HOXA1 蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞核中，其在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)陽性率高于正常結(jié)腸組織，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，見表1和圖2。

圖2 結(jié)腸癌及配對正常組織中HOXA1蛋白的表達(dá)水平(DAB染色×10)Figure 2 Expression of HOXA1 protein in colon cancer tissue and corresponding normal tissues(DAB staining×10)

表1 結(jié)腸癌及配對正常組織中HOXA1蛋白的表達(dá)水平比較[例(%)]Table 1 Comparison of HOXA1 expression level in human colon cancer tissue and corresponding normal tissue[n(%)]

2.4 HOXA1 表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)系 結(jié)腸癌組織中，HOXA1 的表達(dá)水平與患者年齡、性別及腫瘤位置無顯著相關(guān)性(P＞0.05)；HOXA1 表達(dá)水平與AJCC 分期、腫瘤浸潤深度(T 分期)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及組織學(xué)分型相關(guān)(P＜0.05)，見表2。HOXA1 表達(dá)越強，患者AJCC 分期越晚，具備組織學(xué)分型差的高危因素。

表2 203例結(jié)腸癌中HOXA1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系(例)Table 2 The relationship between HOXA1 expression and clinicopathological characteristics in 203 cases of colon cancer(n)

3 討論

結(jié)腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，其發(fā)生發(fā)展是由遺傳物質(zhì)改變和外部環(huán)境相互綜合作用長期演變的結(jié)果。目前針對結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展機制尚未完全闡明，但與之相關(guān)的新型分子生物標(biāo)志物篩選為其提供了新的治療方向[8]。同源異形盒基因A1(HOXA1)作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因參與了腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。血管新生是惡性腫瘤重要的生物學(xué)特征，HOX基因家族成員在血管新生中具備正向調(diào)控及反向調(diào)控的作用。例如：HOXA3 可通過上調(diào)ICAM1、MMP14 等基因的表達(dá)促進血管新生，而HOXA5、HOXB13 則通過下調(diào)VEGFR2、HIF1α、ephrin A1等血管生成基因的表達(dá)發(fā)揮抑制血管新生的作用[9]。文獻報道HOXA1的異常高表達(dá)可以促進肺癌、黑色素瘤、胰腺癌等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[10-11]。HOXA1 廣泛存在于乳腺上皮細(xì)胞，其異常高表達(dá)能夠促進乳腺上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化，進而調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路促進乳腺癌的發(fā)生發(fā)展[12-14]。在乳腺癌中，RBCK1/HOIL-1 以及TRAF2 是HOXA1 的下游特異性靶點。HOXA1通過與TRAF2啟動子序列結(jié)合直接激活TRAF2，進而活化IκB激酶(IKK)并磷酸化降解IκBα，激活NF-κB信號通路，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖活性增加、凋亡減少等惡性生物學(xué)行為改變[15-16]。

本研究應(yīng)用結(jié)腸癌新鮮冰凍樣本檢測HOXA1 mRNA 的表達(dá)情況，結(jié)果顯示HOXA1 在結(jié)腸癌組織中的mRNA表達(dá)水平顯著高于正常結(jié)腸組織。203例結(jié)腸癌石蠟樣本中進一步免疫組化結(jié)果顯示，62.56%的結(jié)腸癌組織中高表達(dá)HOXA1，顯著高于對照組，此結(jié)果與轉(zhuǎn)錄水平檢測結(jié)果一致。結(jié)腸癌中HOXA1的高表達(dá)與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及組織學(xué)分型相關(guān)，而與年齡，性別及腫瘤位置無顯著相關(guān)。HOXA1 高表達(dá)的患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為85.71%，而陰性表達(dá)的患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率僅為14.28%。HOXA1 在Ⅲ～Ⅳ期結(jié)腸癌患者中的高表達(dá)比例顯著高于Ⅰ～Ⅱ期結(jié)腸癌的患者(82.65%vs 43.81%)。上述結(jié)果提示高表達(dá)HOXA1的結(jié)腸癌患者具備預(yù)后不良的高危因素。

綜上所述，HOXA1 異常高表達(dá)在結(jié)腸癌進展過程中起到重要的作用，HOXA1 異常高表達(dá)的結(jié)腸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高，臨床分期晚，提示此類患者預(yù)后不良，HOXA1 可能為判斷結(jié)腸癌預(yù)后的新型分子標(biāo)志物。但是HOXA1促進結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)機制尚未明確，需要進一步研究探討。