何旋，陳文達(dá)，潘志國

解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科/解放軍熱區(qū)損傷與組織修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510010

重癥中暑是機(jī)體暴露于高環(huán)境溫度或劇烈運(yùn)動(dòng)后，機(jī)體核心體溫超過40℃以中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害為主要特征的急性熱損傷相關(guān)疾病，?？砂殡S全身炎癥反應(yīng)綜合征，患者病情進(jìn)一步加重將繼發(fā)多臟器功能衰竭(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)甚至危及患者生命[1-2]。目前大量研究表明，在重癥中暑的病理生理過程中，涉及內(nèi)皮細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞的損傷以及凝血系統(tǒng)的失衡[3]；大量炎癥因子的釋放通過炎凝通路互相作用進(jìn)而引發(fā)MODS，其中血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cells，VECs)是中暑發(fā)病過程中損傷最早的細(xì)胞，其損傷被認(rèn)為是重癥中暑病理生理進(jìn)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[4-5]。但目前重癥中暑導(dǎo)致VECs損傷并繼發(fā)炎癥反應(yīng)的具體機(jī)制仍不明確。P-選擇素、E-選擇素及細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)均屬于細(xì)胞黏附因子選擇素家族，當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞受到各種理化因素刺激時(shí)，上述黏附因子選擇素家族表達(dá)量增加[6]，從而介導(dǎo)白細(xì)胞和血小板的黏附和聚集，進(jìn)而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生一系列炎癥反應(yīng)過程，加重病情發(fā)展。本研究旨在觀察熱打擊對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)(HUVEC)重要黏附因子P-選擇素、E-選擇素及ICAM-1 表達(dá)的影響，以探討熱打擊后血管內(nèi)皮細(xì)胞參與的部分機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料與試劑 P-selectin 購買自SANTA CRUZ，貨號(hào)sc-6943)；E-selectin 及ICAM-1均購買自Abcam，貨號(hào)分別為ab185698 及ab53013)；Anti-mouse IgG HRP-linked Antibody、Anti-rabbit IgG HRP-linked Antibody 及GAPDH 均購買于北京瑞康生物。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(HUVEC)為南方醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送。HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中。將HUVEC 細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日根據(jù)細(xì)胞生長情況換液。每隔2～3 d進(jìn)行1次傳代(傳代比例為1∶2～1∶5)。

1.3 細(xì)胞分組與熱打擊 對(duì)照組將細(xì)胞始終置于正常細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；熱打擊溫度梯度組分別置于不同溫度梯度(40℃、41℃、42℃、43℃)細(xì)胞培養(yǎng)箱打擊2 h，43℃熱打擊不同復(fù)溫組于43℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中打擊2 h，然后置于正常細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(按不同復(fù)溫時(shí)間點(diǎn)復(fù)溫0 h、3 h、6 h、12 h)。

1.4 Western blot 檢測(cè)P-選擇素、E-選擇素及ICAM-1的表達(dá) 按照上述分組處理細(xì)胞。用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細(xì)胞3 次，每個(gè)6 cm 的培養(yǎng)皿加入50 μL RIPA裂解液在冰上裂解20 min。收集細(xì)胞裂解液低溫高速離心(4℃，12 000 r/min，離心15 min)，收集上清于新EP 管。用BCA 蛋白定量/濃度測(cè)定試劑盒測(cè)蛋白濃度。每個(gè)泳道30 μg 蛋白總量進(jìn)行Western blot 檢測(cè)。Western blot 檢測(cè)P-選擇素、E-選擇素及ICAM-1的表達(dá)。

1.5 免疫熒光觀察HUVEC 細(xì)胞P-選擇素及E-選擇素表達(dá) 將傳代后的細(xì)胞置于激光共聚焦小皿。熱打擊溫度梯度組為分別置于不同溫度梯度(40℃、41℃、42℃、43℃)細(xì)胞培養(yǎng)箱打擊2 h，43℃熱打擊不同復(fù)溫組于43℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中打擊2 h，然后置于正常細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(按不同復(fù)溫時(shí)間點(diǎn)復(fù)溫0 h、3 h、6 h、12 h)。復(fù)溫結(jié)束后將皿中培養(yǎng)液移除，PBS 清洗后分別加入4%多聚甲醛固定及使用0.2%Triton X-100 通透，依次加入熒光一抗、二抗及DAPI在激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均采用Prism 6.0 軟件(GraphPad Software,Inc.,La Jolla,CA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 溫度梯度熱打擊對(duì)HUVEC 細(xì)胞P-選擇素表達(dá)的影響 分別用溫度為40℃、41℃、42℃及43℃熱打擊HUVEC 細(xì)胞2 h，結(jié)果顯示，內(nèi)皮細(xì)胞在正常情況下可表達(dá)一定量P-選擇素，不同溫度梯度熱打擊HUVEC細(xì)胞后P-選擇素的表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.859 7，P=0.510 1＞0.05)，見圖1。

圖1 不同溫度熱打擊對(duì)HUVEC細(xì)胞P-選擇素表達(dá)的影響Figure 1 Effect of heat stress at different temperatures on the expression of P-selectin in HUVEC cells

2.2 43℃熱打擊后不同復(fù)溫時(shí)間點(diǎn)HUVEC細(xì)胞P-選擇素表達(dá)的變化 為了進(jìn)一步觀察不同復(fù)溫時(shí)間點(diǎn)HUVEC細(xì)胞P-選擇素表達(dá)水平的變化，用43℃熱打擊HUVEC細(xì)胞2 h，隨后置于37℃孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)至不同時(shí)間點(diǎn)(0 h、3 h、6 h、12 h)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，43℃熱打擊2 h后不同復(fù)溫時(shí)間點(diǎn)，HUVEC細(xì)胞P-選擇素表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.282 1，P=0.885 0＞0.05)，見圖2、圖3。

圖2 43℃熱打擊2 h后不同復(fù)溫時(shí)間點(diǎn)HUVEC細(xì)胞P-選擇素的表達(dá)Figure 2 The expression of P-selectin at different rewarming time points after 2 hours of heat stress at 43℃

圖3 共聚焦檢測(cè)43℃熱打擊組不同復(fù)溫時(shí)間點(diǎn)HUVEC細(xì)胞P-選擇素的表達(dá)Figure 3 The immunofluorescence of P-selectin at different rewarming time points after 2 hours of heat stress at 43℃

2.3 熱打擊對(duì)HUVEC細(xì)胞E-選擇素的影響 上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，無論是不同溫度熱打擊，抑或是43℃熱打擊不同復(fù)溫時(shí)間點(diǎn)均對(duì)HUVEC 細(xì)胞P-選擇素表達(dá)無影響，為了進(jìn)一步觀察熱打擊對(duì)HUVEC 細(xì)胞E-選擇素表達(dá)的影響，用43℃熱打擊HUVEC 細(xì)胞2 h，隨后置于37℃孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)至不同時(shí)間點(diǎn)(0 h、3 h、6 h、12 h)，結(jié)合WB及免疫熒光圖可見，在不受外界刺激情況下，HUVEC僅表達(dá)少量E-選擇素，并且主要表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞表面，熱打擊可使HUVEC 細(xì)胞表面E-選擇素表達(dá)明顯增加，且隨著復(fù)溫時(shí)間延長而增加，在復(fù)溫6 h時(shí)達(dá)最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=20.23，P＜0.05)，見圖4、圖5。而后隨著復(fù)溫時(shí)間延長而降低，在復(fù)溫12 h降至基底水平。

圖4 43℃熱打擊2 h后不同復(fù)溫時(shí)間點(diǎn)HUVEC細(xì)胞E-選擇素的表達(dá)Figure 4 The expression of E-selectin at different rewarming time points after 2 hours of heat stress at 43℃

圖5 共聚焦檢測(cè)43℃熱打擊不同復(fù)溫時(shí)間點(diǎn)HUVEC細(xì)胞E-選擇素表達(dá)的變化Figure 5 The immunofluorescence of E-selectin at different rewarming time points after 2 hours of heat stress at 43℃

2.4 熱打擊對(duì)HUVEC 細(xì)胞ICAM-1 表達(dá)的影響 進(jìn)一步觀察熱打擊對(duì)HUVEC 細(xì)胞黏附因子選擇素家族另一成員ICAM-1 表達(dá)的影響，用43℃熱打擊HUVEC細(xì)胞2 h，隨后置于37℃孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)至不同時(shí)間點(diǎn)(0 h、3 h、6 h、12 h)。結(jié)果顯示，熱打擊可使HUVEC 細(xì)胞ICAM-1 表達(dá)隨復(fù)溫時(shí)間延長而增加，在復(fù)溫6 h 時(shí)達(dá)最高，同樣至復(fù)溫12 h降至正常水平，趨勢(shì)與E-選擇素基本一致，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=16.93，P＜0.05)，見圖6。

圖6 43℃熱打擊組不同復(fù)溫時(shí)間點(diǎn)HUVEC細(xì)胞ICAM-1的表達(dá)Figure 6 The expression of ICAM-1 at different rewarming time points after 2 hours of heat stress at 43℃

3 討論

重癥中暑是以高熱和中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷為主要表現(xiàn)的急性熱損傷相關(guān)疾病。既往研究認(rèn)為，重癥中暑病理生理過程中，其重要臟器損害主要來源于熱暴露的直接細(xì)胞毒性作用[7-8]。目前越來越多證據(jù)表明，重癥中暑引起臟器功能損害的病理生理學(xué)過程是一種繼發(fā)于熱損傷之后，炎癥和應(yīng)激作用下機(jī)體炎性反應(yīng)呈“瀑布樣”引發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征，繼而引起彌漫性血管內(nèi)凝血(disseminated intravascular coagulation，DIC)及MODS9。血管內(nèi)皮細(xì)胞在大量細(xì)胞因子作用下可釋放多種細(xì)胞因子及黏附分子，進(jìn)而表現(xiàn)為“類膿毒癥”反應(yīng)，引發(fā)凝血反應(yīng)產(chǎn)生凝血功能紊亂甚至DIC，凝血反應(yīng)進(jìn)一步加劇炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生更多炎癥因子，加重組織細(xì)胞損傷和器官功能障礙，并最終導(dǎo)致MODS[10-11]。因此，血管內(nèi)皮損傷繼發(fā)的凝血功能紊亂和MODS被認(rèn)為是重癥中暑的關(guān)鍵性環(huán)節(jié)[12]。

細(xì)胞黏附分子包括經(jīng)典的免疫球蛋白超家族(ICAM-1、VCAM-1)、選擇素家族(P-、E-、L-選擇素)、整合素分子和非經(jīng)典如VAP-1 和CD44 等分子，通過介導(dǎo)炎癥細(xì)胞與組織或內(nèi)皮細(xì)胞黏附參與炎癥與免疫應(yīng)答反應(yīng)，并在出凝血過程、創(chuàng)傷后傷口愈合、腫瘤細(xì)胞的浸潤與轉(zhuǎn)移等多種病理生理過程中發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能[13]。為此，本實(shí)驗(yàn)在體外模擬HUVEC熱應(yīng)激的過程，觀察熱打擊HUVEC細(xì)胞后P-選擇素、E-選擇素及ICAM-1 表達(dá)的影響，由此分析重癥中暑發(fā)病過程中血管內(nèi)皮細(xì)胞參與的部分機(jī)制。

目前大量研究表明P-選擇素在機(jī)體內(nèi)能以膜蛋白和可溶性蛋白分別儲(chǔ)存在血小板和內(nèi)皮細(xì)胞、血液循環(huán)中，在血小板及內(nèi)皮細(xì)胞被激活后，P-選擇素在幾分鐘內(nèi)易位到細(xì)胞表面上[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，使用不同溫度梯度熱打擊2 h及43℃熱打擊2 h不同復(fù)溫時(shí)間點(diǎn)，WB檢測(cè)HUVEC細(xì)胞P-選擇素的表達(dá)水平及免疫熒光觀察HUVEC細(xì)胞表面P-選擇素的表達(dá)均無明顯差異，該結(jié)果與既往文獻(xiàn)中研究結(jié)果存在差異，可能與P-選擇素表達(dá)方式有關(guān)。P-選擇素在正常內(nèi)皮細(xì)胞主要儲(chǔ)存于Weibel-Palade 小體，刺激后快速移位于內(nèi)皮細(xì)胞表面，其最大表達(dá)量為刺激后5～10 min，30～60 min內(nèi)P-選擇素從細(xì)胞表面清除。本研究的熱打擊時(shí)間為2 h，推測(cè)熱打擊早期過程中即有P-選擇素表達(dá)改變，而隨打擊時(shí)間及復(fù)溫時(shí)間延長P-選擇素已從細(xì)胞表面清除并脫落致細(xì)胞上清中，故實(shí)驗(yàn)結(jié)果中未能觀察到P-選擇素有表達(dá)差異，如有條件可進(jìn)一步使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞上清中P-選擇素濃度，從而進(jìn)一步驗(yàn)證熱打擊對(duì)HUVEC細(xì)胞P-選擇素表達(dá)影響。

E-選擇素在正常內(nèi)皮細(xì)胞基本不表達(dá)，在炎癥因子、腫瘤壞死因子TNF-α等的刺激下活化并表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞外膜[16]，介導(dǎo)白細(xì)胞滾動(dòng)并粘附于內(nèi)皮細(xì)胞。有研究發(fā)現(xiàn)，在T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)中，T細(xì)胞主要通過其表面的黏附分子整合素家族與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面選擇素家族經(jīng)過配體與受體相結(jié)合，參與T 細(xì)胞發(fā)生滾動(dòng)、停滯進(jìn)而遷移，通過內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞間質(zhì)，最終到達(dá)損傷部位[17]。亦有研究表明，E-選擇素與全身炎癥反應(yīng)綜合征的嚴(yán)重程度存在明顯相關(guān)性，并可作為其判斷嚴(yán)重程度和預(yù)后的相關(guān)指標(biāo)[18]。另外有研究發(fā)現(xiàn)，使用中暑小鼠血清刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞，VCAM-1 及ICAM-1 的表達(dá)顯著上調(diào)，對(duì)單核細(xì)胞的黏附能力增加，表明內(nèi)皮細(xì)胞表面的黏附分子參與了中暑白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附[19-20]。本研究中熱打擊使HUVEC 細(xì)胞E-選擇素及ICAM-1 表達(dá)明顯增加，在復(fù)溫6 h 達(dá)峰值，隨后12 h 后降到基底水平，這與既往研究結(jié)果相一致[21]：相對(duì)于P-選擇素可儲(chǔ)存模式，刺激后E-選擇素的表達(dá)需要從頭轉(zhuǎn)錄。因此，E-選擇素在刺激3～4 h 后細(xì)胞表面可檢測(cè)到，在16～24 h后下降到基礎(chǔ)水平。

基于上述研究結(jié)果，我們推測(cè)熱打擊可能主要通過E-選擇素及ICAM-1介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞參與炎癥反應(yīng)，在中暑的“類膿毒癥”反應(yīng)起到相關(guān)重要的作用，而P-選擇素在其中的作用仍不明確，下一步研究中將進(jìn)一步完善相關(guān)檢測(cè)方法，從而明確P-選擇素在熱打擊中的表達(dá)改變及可能作用機(jī)制。本研究將有助于了解重癥中暑內(nèi)皮損傷及炎癥反應(yīng)之間的相互關(guān)系，為中暑“類膿毒癥反應(yīng)”提供研究依據(jù)。