楊可心 王 會 李會

（1.徐州醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇徐州 221004；2.徐州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江蘇徐州 221004）

0 引言

極光激酶A（Aurora-A）是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是近年來廣受關(guān)注的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子。Aurora-A激酶主要定位于有絲分裂期細(xì)胞中心體和紡錘體微管，在中心體復(fù)制階段開始表達(dá)，促進(jìn)中心體的成熟、分離、紡錘體的精確組裝及胞質(zhì)分裂。Aurora-A 以有絲分裂激酶依賴的方式調(diào)控多種細(xì)胞的發(fā)育分化和穩(wěn)態(tài)維持，主要參與調(diào)控G2/M 期的細(xì)胞周期進(jìn)程[1]。多項(xiàng)研究表明，Aurora-A 在造血惡性腫瘤、乳腺癌、結(jié)直腸癌等多種類型的癌癥中異常高表達(dá)，是多種腫瘤治療的靶點(diǎn)分子[2]。

盡管Aurora-A 以有絲分裂激酶依賴的方式調(diào)控多種細(xì)胞的發(fā)育分化和穩(wěn)態(tài)維持，目前有研究指出Aurora-A 也以有絲分裂激酶非依賴的方式調(diào)控細(xì)胞多種生命活動，例如，Aurora-A 調(diào)控免疫突觸的微管形成介導(dǎo)T 細(xì)胞活化[3]、介導(dǎo)微管形成調(diào)控神經(jīng)元軸突延伸等[4]。此外，Aurora-A 作為絲蘇氨酸激酶可通過磷酸化與中心體功能無關(guān)的蛋白質(zhì)，如Taga 等人發(fā)現(xiàn)在U20S 人骨肉瘤細(xì)胞中，Aurora-A 可誘導(dǎo)Akt 和mTOR 癌蛋白的磷酸化，從而促進(jìn)癌細(xì)胞擴(kuò)增[5]。近年來也有研究報(bào)道，Aurora-A 存在著經(jīng)典的SUMO 化保守序列，體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)均證明Aurora-A 通過SUMO 化促進(jìn)自身激酶活性從而確保細(xì)胞的有絲分裂正常進(jìn)行[6]。

Aurora-A 以有絲分裂激酶依賴和非依賴的方式調(diào)控多種細(xì)胞的生命活動，但是Aurora-A 激酶活化的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和具體作用機(jī)制目前還不清楚。研究小鼠Aurora-A 的蛋白性質(zhì)和蛋白結(jié)構(gòu)對研究其功能具有重要的意義，目前尚未見Aurora-A 蛋白性質(zhì)和結(jié)構(gòu)的相關(guān)報(bào)道。本研究利用生物信息學(xué)工具對小鼠Aurora-A 蛋白的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測和分析，旨在為研究Aurora-A 蛋白在生理和病理?xiàng)l件下的功能和調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

從NCBI 獲取小鼠Aurora-A 蛋白的氨基酸序列（GenBank：AAH14711.1）。在線分析工具為 Blast、ExPASy、SOPMA、Swiss Model、NetPhos、SUMOplot、JASSA、GPS-SUMO 等生物信息學(xué)分析軟件。

1.2 方法

利用生物信息學(xué)分析軟件ExPASy 分析Aurora-A 蛋白的理化性質(zhì)和疏水性（https://web.expasy.org/protparam，http://web.expasyweb.expasy.org/ protscale），利用SOPMA 分析Aurora-A 的二級結(jié)構(gòu)（http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html），利用Swiss Model 分析Aurora-A 的三級結(jié)構(gòu)（https://swissmodel.expasy.org/），利用NetPhos3.1 對Aurora-A的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測（https://services.healthtech.dtu.dk/services/NetPhos-3.1/），利用SUMOplot （http://www.abgent.com/sumoplot)、JASSA（http://www.jassa.fr/）和GPS-SUMO （http://sumosp.biocuckoo.org/）軟件預(yù)測Aurora-A 的SUMO 化位點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Aurora-A 理化性質(zhì)分析

小鼠Aurora-A 分子式為C2083H3325N609O614S14，含417個(gè)氨基酸殘基，由20 種基本氨基酸組成。小鼠Aurora-A蛋白質(zhì)分子量為47172.87u，等電點(diǎn)為9.44，含帶正電荷的氨基酸殘基（賴氨酸+精氨酸）62 個(gè)，帶負(fù)電荷的氨基酸殘基（谷氨酸＋天冬氨酸）46 個(gè)。體外小鼠Aurora-A的半衰期在哺乳動物細(xì)胞中為30h，在酵母中＞20h，在大腸桿菌中＞10h。Aurora-A 蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)為50.61，根據(jù)蛋白質(zhì)穩(wěn)定參數(shù)在40 以下判定為穩(wěn)定蛋白質(zhì)，推測小鼠Aurora-A 屬于不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。Aurora-A 的脂溶系數(shù)為76.42，親水系數(shù)為-0.628，說明該蛋白為親水性蛋白質(zhì)[7]。ProtScale 軟件分析的結(jié)果顯示，絕大多數(shù)氨基酸分值為較低的負(fù)值，表明Aurora-A 是較強(qiáng)的親水性蛋白質(zhì)，小鼠Aurora-A 疏水性分析如圖1 所示。

圖1 小鼠Aurora-A疏水性分析

2.2 Aurora-A 二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)分析

利用SOPMA 分析Aurora-A 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，窗口參數(shù)（Window width）設(shè)置為17，相似閾值（Similarity threshold）設(shè)置為8，狀態(tài)數(shù)（Number of states）設(shè)置為4。結(jié)果顯示，小鼠Aurora-A 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋占27.10%、延伸鏈占11.99%、β-轉(zhuǎn)角占5.28%、無規(guī)則卷曲占55.64%（見圖2A）。利用Swiss Model 軟件對Aurora-A三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，以Aurora-A 為模板（P97477.1.A）進(jìn)行同源建模，預(yù)測結(jié)果如圖2B 所示，GMQE 值為0.71，說明預(yù)測結(jié)構(gòu)可靠。

圖2 小鼠Aurora-A蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)

2.3 Aurora-A SUMO 化位點(diǎn)和磷酸化位點(diǎn)預(yù)測

利用NetPhos 軟件對小鼠Aurora-A 蛋白質(zhì)進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)分析，結(jié)果顯示，Aurora-A 共有43 個(gè)磷酸化位點(diǎn)，判定標(biāo)準(zhǔn)為得分＞0.5（見圖3），其中絲氨酸26 個(gè)、蘇氨酸14 個(gè)、酪氨酸3 個(gè)。利用SUMOplot、JASSA、GPS-SUMO三個(gè)軟件對Aurora-A 蛋白的SUMO 位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，綜合3個(gè)軟件預(yù)測的結(jié)果（見表1），小鼠Aurora-A 的271、322、156 位賴氨酸發(fā)生SUMO 化的可能性最高，且271 位賴氨酸序列與SUMO 化特異性序列Ψ-K-X-E/D 一致。其中，Ψ代表疏水性氨基酸，K 是SUMO 分子共價(jià)結(jié)合的賴氨酸，X 為任意氨基酸，D/E 為酸性氨基酸（天冬氨酸D 或者谷氨酸E）。

表1 小鼠Aurora-A SUMO位點(diǎn)預(yù)測

圖3 小鼠Aurora-A蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測

3 結(jié)論

Aurora-A 是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是近年來廣受關(guān)注的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子，通過生物信息學(xué)分析軟件研究發(fā)現(xiàn)，Aurora-A 是一種不穩(wěn)定的親水性堿性蛋白質(zhì)，共有43 個(gè)磷酸化位點(diǎn)和一個(gè)保守的SUMO 化序列。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是其功能的基礎(chǔ)。通過深入分析Aurora-A 的理化性質(zhì)和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，為進(jìn)一步研究Aurora-A 在生理和病理?xiàng)l件下的功能和調(diào)控機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)是蛋白質(zhì)鑒定、提純、純化的基本依據(jù)，本研究中蛋白質(zhì)理化性質(zhì)預(yù)測結(jié)果顯示，小鼠Aurora-A 是一個(gè)不穩(wěn)定的親水性堿性蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的磷酸化可以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。激活的Aurora-A 是其磷酸化形式，其活化通常發(fā)生在有絲分裂G2/M 期[8]。盡管TPX2、BORA、BuGZ 等已被報(bào)道可激活A(yù)urora-A[9-11],但是Aurora-A 激酶活性的調(diào)控機(jī)制仍知之甚少，本研究預(yù)測發(fā)現(xiàn)，Aurora-A共有43 個(gè)磷酸化位點(diǎn)，將為研究Aurora-A 激酶的活化提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。除了磷酸化，SUMO 化修飾也可調(diào)控蛋白質(zhì)的活性和功能，有研究報(bào)道小鼠精母細(xì)胞中Aurora-A在減數(shù)分裂G2/M 期發(fā)生SUMO 化[12]，但是SUMO 化調(diào)節(jié)Aurora-A 的具體調(diào)控機(jī)制尚不清楚。本研究中發(fā)現(xiàn)Aurora-A的271、322、156 位賴氨酸發(fā)生SUMO 化的可能性最高，且271 位賴氨酸序列與SUMO 化特異性序列Ψ-K-X-E/D 一致，Aurora-A 激酶SUMO 化位點(diǎn)的預(yù)測為深入研究Aurora-A激酶SUMO 化的具體調(diào)控機(jī)制奠定一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

Aurora-A 作為一種重要的有絲分裂激酶調(diào)控多種生命活動。通過生物信息學(xué)方法分析其理化性質(zhì)、蛋白結(jié)構(gòu)和激酶活性位點(diǎn)，可為研究Aurora-A 蛋白在不同的生理和病理?xiàng)l件下的作用和功能提供必要的信息，也可為Aurora-A 參與的相關(guān)疾病研究和疾病治療提供新的思路和分子靶點(diǎn)。