劉寧濤 趙遠玲 車京玉 張起昌 田超 尹雪巍 代麗婷 邵立剛

（1 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院克山分院，齊齊哈爾161005，2 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院作物資源研究所，哈爾濱 150081）

小麥花藥培養(yǎng)是一項快速、有效穩(wěn)定育種材料的技術(shù)，具有穩(wěn)定雜種性狀、縮短育種年限、選擇效率高等優(yōu)點[1-2]，也是產(chǎn)生單倍體材料的主要方法之一。圍繞小麥花藥培養(yǎng)過程中供體材料的基因型、培養(yǎng)基、愈傷組織誘導(dǎo)、綠苗分化及染色體加倍技術(shù)中效率低的問題，科學家們開展了大量的研究使得小麥花藥培養(yǎng)效率得到一定的提高，同時也相繼育成了京花1 號、Florida、花培5 號、花培28 號、豫麥37、寧春50 等小麥品種應(yīng)用于生產(chǎn)[3-5]。然而供體材料的基因型仍然是影響花藥培養(yǎng)的主要因素[6-8]，在配制雜交組合的過程中需選擇培養(yǎng)能力強的材料作為親本，以減少花培對基因型的依賴，提高培養(yǎng)效率，除此之外培養(yǎng)基、激素配比、培養(yǎng)條件、碳源等也是影響花藥培養(yǎng)的關(guān)鍵因素。最新研究成果表明麥芽糖作為碳源能夠形成胚狀體并進一步再生植株，且能夠有效減少白化苗的再生[9]。在花藥培養(yǎng)方式方面的研究也表明浸潤式培養(yǎng)、液體培養(yǎng)方式[10]能夠得到更多的愈傷組織和綠苗，說明利用液體培養(yǎng)能夠有效地提高小麥花藥培養(yǎng)效率。周迪等[11]引進匈牙利小麥液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基W14-F，對人工合成小麥和普通小麥F1花藥培養(yǎng)愈傷組織誘導(dǎo)研究，發(fā)現(xiàn)該培養(yǎng)基在愈傷組織誘導(dǎo)率方面明顯高于國內(nèi)普遍應(yīng)用的C17、N6 和1/2 MS 培養(yǎng)基。

本實驗室采用匈牙利小麥育種家Pauk Janos 花藥漂浮培養(yǎng)技術(shù)[12]，并在其基礎(chǔ)上簡化了生根培養(yǎng)、優(yōu)化了預(yù)處理等環(huán)節(jié)，愈傷組織產(chǎn)出明顯提高，同時2021 年加倍率達到了64.6%，大幅度提高了小麥花藥培養(yǎng)的效率。為了更好地促進我國小麥花藥培養(yǎng)育種技術(shù)，對實驗室運用的小麥花藥漂浮培養(yǎng)技術(shù)進行梳理，期望能夠為國內(nèi)利用小麥花藥培養(yǎng)技術(shù)開展單倍體選擇的育種者們提供參考。

1 花藥培養(yǎng)基配制

小麥花藥愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為W14-F，再生培養(yǎng)基為190-2Cu，具體配方見表1。

表1 小麥花藥誘導(dǎo)、分化、生根培養(yǎng)基配方

W14-F 誘導(dǎo)漂浮培養(yǎng)基配制完成后分裝于培養(yǎng)皿中，每皿分裝液體培養(yǎng)基12mL，用封口膜封口后滅菌，備用。190-2Cu 分化培養(yǎng)基為固體培養(yǎng)基，分裝于直徑為9cm 的培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿中10mL 培養(yǎng)基，滅菌備用。培養(yǎng)基pH 值為5.8。

2 花藥培養(yǎng)步驟[14]

2.1 外植體選擇與預(yù)處理外植體選擇 選擇F2重點組合作為外植體進行花藥培養(yǎng)。外植體取材與預(yù)處理 取大田種植的健壯植株，用顯微鏡進行鏡檢，選擇小孢子發(fā)育正處于單核靠邊期的幼穗最佳；形態(tài)學上一般表現(xiàn)為幼穗頂部處于旗葉與旗葉葉耳1/3～2/3 處的植株，用剪刀沿著莖部斜口剪斷，每個組合取20～30 穗，并用橡皮筋捆成一捆，寫好標簽，后放入裝有自來水的小桶中，盡快帶回實驗室。用塑料密封袋密封后置于4℃冰箱內(nèi)低溫處理3d。外植體滅菌 接種之前將幼穗剝出后放入血清瓶中，加入一定量的消毒液（次氯酸鈉和無菌水比例為1∶1），并加入2 滴土溫80，水平方向放至搖床上震蕩20min。血清瓶用75%的乙醇擦拭消毒后放入超凈工作臺中，倒出消毒液，后用無菌水沖洗幼穗3～4 次，直到瓶內(nèi)不再產(chǎn)生泡沫為止。

2.2 誘導(dǎo)方法接花藥手部用75%乙醇消毒晾干后取已高壓滅菌的小鑷子一把，蘸取75%的乙醇再用酒精燈外焰烤火滅菌，之后放旁邊冷卻備用。接花藥時用左手夾住已滅菌的幼穗，用小鑷子去掉穎殼剝出花藥，放置于培養(yǎng)基上。愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)將取出的小麥花藥放入裝有誘導(dǎo)培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中（直徑9cm），每個培養(yǎng)皿中約300 個花藥，接種完成后需用封口膜及時密封。把密封好的培養(yǎng)皿放入恒溫培養(yǎng)箱中，在32℃下暗培養(yǎng)3d，再轉(zhuǎn)入28℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)50～60d。愈傷組織分化培養(yǎng) 當愈傷組織形成后，直徑1～2mm 時，及時在無菌環(huán)境下將愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱條件為25±1℃、16h 光照培養(yǎng)，光強2000～3000Lx，8h 暗培養(yǎng)，30d 左右會出現(xiàn)綠苗。

2.3 花藥培養(yǎng)加倍技術(shù)綠苗出現(xiàn)2～3 片綠葉時，轉(zhuǎn)入盆栽，待新根生長健壯后移到溫室內(nèi)煉苗3～4d，后移栽到花盆中。

2.3.1 化學藥劑加倍法分蘗期將單倍體綠苗根部用自來水沖洗干凈，剪去根尖留約2cm 左右，根部浸入含有0.2%秋水仙堿+2%DMSO（二甲基亞砜）的溶液中5h，隨后用自來水沖洗過夜、移栽，保持高濕環(huán)境下16h 光照，白天溫度18℃，晚上15℃，約2周出現(xiàn)新分蘗后正常管理。

2.3.2 自然加倍法綠苗出現(xiàn)分蘗時給予適當?shù)牡蜏孛{迫約6 周，弱光條件下能夠?qū)崿F(xiàn)部分植株自然加倍。

3 花藥培養(yǎng)技術(shù)注意事項

（1）在選擇花藥培養(yǎng)組合時，其親本之一應(yīng)具有強培養(yǎng)力且一般配合力高，以減少花培材料對基因型的依賴，進而提高花藥培養(yǎng)的效率。（2）多數(shù)情況下研究者們選擇F1組合材料進行花藥培養(yǎng)。匈牙利小麥花藥培養(yǎng)過程中在F1對主要流行性病害等不利性狀進行一次淘汰，選擇F2植株進行花藥培養(yǎng)，這樣獲得的植株更加接近育種目標，這一點值得我們借鑒。（3）花藥培養(yǎng)過程中的污染問題。在進行花藥培養(yǎng)之前需要對培養(yǎng)室環(huán)境進行徹底消毒，同時要重視對外植體材料和器皿的消毒，也可以在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中適當加入一些抗生素，降低花藥培養(yǎng)過程中污染率。另外，匈牙利的漂浮誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入了Ficoll（一種聚蔗糖），對于污染有一定的抑制作用，其作用有待于進一步研究。（4）外植體預(yù)處理時要注意密封性，并保持一定的濕度，防止外植體材料水分散失；恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)期間也需保持一定濕度；綠苗移栽中也一定要保持濕度，提高幼苗的成活率。（5）經(jīng)誘導(dǎo)形成的愈傷組織直徑達到1～2mm 時及時轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中進行再培養(yǎng)，直徑超過2mm，其再生能力會有所下降。（6）花藥培養(yǎng)過程中盡量多接種花藥，構(gòu)建大量的基礎(chǔ)群體，以便于能夠獲得較多的理想植株。