劉凱 張聿軻 冬梅 王建忠

1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古自治區(qū) 呼和浩特 010030 2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古自治區(qū) 呼和浩特010020

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種中老年人易患的以骨密度下降、骨質(zhì)量降低、骨微結(jié)構(gòu)退化為特征的全身骨代謝障礙性疾病[1]。2018年全國性流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示我國 50歲以上人群骨質(zhì)疏松癥患病率為19.2%[2]。OP發(fā)生主要是成骨細(xì)胞(osteoblast，OB)骨形成和破骨細(xì)胞(osteoclast，OC)骨吸收失衡，使骨量減少和(或)骨微結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致骨脆性增加、骨強(qiáng)度下降、皮質(zhì)骨變薄，進(jìn)而發(fā)生病理性骨折[3]。目前，OP治療以藥物為主，通過減少骨吸收或增加骨形成治療OP[4]。然而效果并不理想，亟需新的治療干預(yù)措施。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC)具有自我更新和分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞或軟骨細(xì)胞等的能力，被廣泛應(yīng)用于再生骨科[5]。通過促進(jìn)BMSC成骨分化維持骨代謝平衡可改善骨密度，為OP治療提供了新策略[6]。長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是一種長度超過200 nt無蛋白質(zhì)編碼能力的核糖核酸，與骨代謝相關(guān)疾病密切相關(guān)，通過調(diào)控骨細(xì)胞增殖、分化、凋亡等細(xì)胞代謝途徑參與OP進(jìn)程[7]。其中l(wèi)ncRNA分化拮抗非蛋白編碼RNA(differentiation antagonizing non-protein coding RNA，DANCR)是維持表皮干細(xì)胞或成骨細(xì)胞未分化狀態(tài)所必需的分子，也是促進(jìn)組織再生的潛在靶點(diǎn)[8]，可能作為潛在的生物靶點(diǎn)和臨床干預(yù)手段為OP的診斷與治療提供新視角。而DANCR調(diào)控BMSC成骨分化影響OP進(jìn)程的機(jī)制尚未完全闡明。本文就DANCR在BMSC成骨分化中的作用及相關(guān)機(jī)制進(jìn)行綜述，為探索DANCR作為診斷與治療OP的新分子靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 DANCR與BMSC成骨分化概述

DANCR編碼基因位于人類染色體4q12上，全長915 bp，在表皮祖細(xì)胞群體和分化細(xì)胞的研究中，其表達(dá)量在角質(zhì)形成細(xì)胞的終末分化過程中會顯著下調(diào)[9]。DANCR可在骨肉瘤等多種腫瘤中調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖凋亡、遷移侵襲等細(xì)胞功能，是一種區(qū)分癌癥患者和健康人群診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物[10]。同時(shí)，DANCR可能通過激活細(xì)胞自噬抑制血管平滑肌細(xì)胞的成骨分化來減輕動(dòng)脈鈣化[11]。此外，DANCR也是牙齒組織來源的干細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)因子，參與牙周韌帶干細(xì)胞 (periodontal ligament stem cells，PDLSC)等干細(xì)胞的成骨分化，對于牙齒組織再生修復(fù)具有重要的意義[12]。BMSC是一種存在于骨髓中的間充質(zhì)干細(xì)胞，因易從成體組織中分離且具有廣泛的增殖和分化成各種細(xì)胞譜系的能力作為主要研究對象，在維持正常骨穩(wěn)定方面起著重要作用。BMSC成骨分化受到抑制可導(dǎo)致骨形成減少，是OP重要發(fā)病因素之一。BMSC成骨分化的過程中受到眾多因素的影響，其中DANCR可以通過競爭內(nèi)源性RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)、作為轉(zhuǎn)錄輔助因子等機(jī)制調(diào)控BMSC成骨分化來參與OP的發(fā)生與發(fā)展，是OP診斷和治療的潛在手段[8]。

2 BMSC參與OP治療

在OP發(fā)展過程中，常伴有BMSC成骨成脂分化失衡，導(dǎo)致骨骼中OB的數(shù)量減少和質(zhì)量降低，骨髓脂肪增加，使得骨形成減少和骨微架構(gòu)受損，增加骨折和骨折愈合困難的風(fēng)險(xiǎn)[13]。抑制BMSC中Zust同源增強(qiáng)子2(EZH2)的活性或降低EZH2基因表達(dá)都可以導(dǎo)致脂肪生成減少和成骨增加，而抑制DANCR表達(dá)可作用于EZH2促進(jìn)BMSC成骨分化[14]。表明靶向抑制DANCR表達(dá)在一定程度上可以恢復(fù)機(jī)體BMSC成骨成脂分化平衡，進(jìn)而延緩OP的發(fā)生發(fā)展。BMSC移植在原發(fā)性與繼發(fā)性O(shè)P的治療中都具有明顯的效果。目前已有多項(xiàng)臨床前研究探討自體和異體BMSC移植在各種動(dòng)物模型中的作用。在糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的OP小鼠模型中注射同種異體的BMSC，基于供體BMSC在受體骨髓中定植和發(fā)揮作用可以促進(jìn)OB的形成[15]。將自體 BMSC移植到卵巢切除術(shù)(Ovariectomy，OVX)兔模型中后，治療組骨連接增多，骨剛度增強(qiáng)，小梁厚度增加并且有新形成的類骨質(zhì)的顯微結(jié)構(gòu)[16]；在山羊絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)模型中也獲得了類似的效果[17]。動(dòng)物模型研究表明，自體和異體BMSC移植在OP的治療方面有廣闊的前景。在臨床試驗(yàn)中也有移植自體BMSC治療OP的研究。在西班牙圣母瑪利亞醫(yī)院以自體BMSC為干預(yù)的臨床試驗(yàn)(注冊號：NCT 02566655，靜脈輸注巖藻糖基化骨髓間充質(zhì)細(xì)胞治療骨質(zhì)疏松癥)中，操作者在移植前30 d左右從患者體內(nèi)收集自體BMSC，培養(yǎng)擴(kuò)增并進(jìn)行巖藻糖化后靜脈注射到OP患者體內(nèi)。10例患者接受不同劑量注射，24個(gè)月后，用生化指標(biāo)測量骨吸收等相關(guān)指標(biāo)，測量骨密度并用組織形態(tài)學(xué)評估骨結(jié)構(gòu)[18]。然而，由于BMSC總數(shù)隨年齡增長而下降，使用自體BMSC治療老年患者OP存在一些不確定性，目前該臨床試驗(yàn)尚未報(bào)告具體結(jié)果[19]。由此可見，增加正常BMSC含量或在分子水平靶向調(diào)控BMSC分化方向，刺激其向OB分化并合成新骨可能是治療OP的一種潛在方法。

3 DANCR調(diào)控BMSC成骨分化

OB和OC是骨組織細(xì)胞的主要成分，支撐著骨的主要代謝活動(dòng)，二者代謝平衡對于OP有重要的影響。DANCR可以通過多途徑調(diào)控BMSC及OP相關(guān)細(xì)胞成骨分化影響OP的進(jìn)程(表1、圖1)。同時(shí)，DANCR在其他多種間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中也起到關(guān)鍵作用。

表1 DANCR調(diào)控OP相關(guān)細(xì)胞成骨分化的研究總結(jié)Table 1 Summary of studies on DANCR regulating osteogenic differentiation of OP related cells

圖1 DNACR調(diào)控成骨分化示意圖Fig.1 Schematic chart of osteogenic differentiation regulated by DANCR注：①～⑤代表DANCR通過多途徑影響細(xì)胞成骨分化，⑥代表DNACR影響破骨細(xì)胞生成。

3.1 調(diào)控miR-320a/CTNNB1/Wnt通路影響成骨分化

Wnt/β-catenin信號通路通過刺激OB生成和減少OC分化在骨穩(wěn)態(tài)中起重要作用，抑制Wnt/β-catenin信號通路可以減少成骨分化[20]。在成骨過程中，當(dāng)Wnt信號被激活時(shí)，β-catenin的磷酸化被抑制，使β-catenin聚集并轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)，進(jìn)一步促進(jìn)MSC中成骨細(xì)胞鈣化早期轉(zhuǎn)錄因子鋅指轉(zhuǎn)錄因子(Osterix，Osx)及矮小相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2基因(Runt-related transcription factor 2，RUNX2)的表達(dá)，促進(jìn)OB的早期分化[21]。編碼β-catenin蛋白的基因CTNNB1的異常表達(dá)是Wnt信號通路改變的常見原因，該分子與OP密切相關(guān)[22]。miR-320a在多種疾病中抑制CTNNB1的表達(dá)并調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路[23]。PMOP患者的BMSC中DANCR和miR-320a表達(dá)上調(diào)，CTNNB1表達(dá)下調(diào)。加入miR-320a抑制劑后可以激活Wnt/β-Catenin信號通路，增加BMSC中Runx2、Osx等的表達(dá)，加速成骨礦化。而在BMSC中過表達(dá)DANCR后，抵消了miR-320a抑制劑對成骨分化和β-catenin通路的激活作用。雖然DANCR和miR-320a的表達(dá)水平?jīng)]有相互影響，但過表達(dá)DANCR或miR-320a都降低了CTNNB1熒光素酶活性和β-catenin的表達(dá)，并且二者對于CTNNB1的影響存在協(xié)同效應(yīng)[24]。此外，通過敲除MC3T3-E1小鼠成骨細(xì)胞系中的DANCR基因可以激活經(jīng)典Wnt/β-catenin 信號通路，增加Osx和Runx2等促分化相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)水平，促進(jìn)成骨分化[25]。

3.2 調(diào)控p38/MAPK通路影響成骨分化

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)家族在細(xì)胞生理調(diào)節(jié)中起到重要作用，其激活是成骨分化的重要觸發(fā)因素，主要包含氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)和p38等MAPK分支通路[26]。MAPK家族可調(diào)控BMSC的分化、礦化和增殖[27]。激活MAPK通路可有效提高OB的活性并促進(jìn)骨基質(zhì)的分泌與鈣化，利于機(jī)體骨形成[28]。在肝癌細(xì)胞中，DANCR可以通過海綿吸附作用調(diào)節(jié)miR-125b-5p并激活MAPK通路，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖[29]。而沉默DANCR通過激活p38/MAPK信號通路抑制骨肉瘤細(xì)胞的遷移和侵襲[30]。比較未分化和成骨分化的BMSC中DANCR的差異表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)，在成骨分化過程中，BMSC中DANCR的表達(dá)水平顯著降低[31]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在成骨補(bǔ)充培養(yǎng)液培養(yǎng)基中培養(yǎng)BMSC能增強(qiáng)ERK1/2、JNK和p38的磷酸化，但真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)，只有磷酸化p38的表達(dá)水平明顯降低，用p38特異性抑制劑處理真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的BMSC后發(fā)現(xiàn)ALP活性與礦化基質(zhì)沉積被抑制，表明敲降DANCR可以通過p38/MAPK而非JNK/MAPK、ERK1/2/MAPK通路促進(jìn)BMSC的成骨分化[31]。

3.3 調(diào)控miR-1301-3p/PROX1軸影響成骨分化

miR-1301-3p與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，在前列腺癌細(xì)胞和組織中顯著上調(diào)，促進(jìn)前列腺癌干細(xì)胞的擴(kuò)增[32]。最新研究發(fā)現(xiàn)，miR-1301-3p在細(xì)胞成骨分化的過程中也起到至關(guān)重要的作用。Circ8500可通過海綿吸附miR-1301-3p上調(diào)肽基精氨酸脫亞胺酶4(peptidyl arginine deiminase 4，PADI4)的表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞基質(zhì)礦化[33]。此外，miR-1301-3p可以通過促進(jìn)礦化來加速大鼠BMSC向OB的分化[34]。Prospero相關(guān)同源異形盒蛋白1 (prospero homeobox 1，PROX1)是一種轉(zhuǎn)錄因子，過表達(dá)后可誘導(dǎo)人類脂肪干細(xì)胞分化為淋巴管內(nèi)皮樣細(xì)胞[35]。多數(shù)據(jù)庫聯(lián)合生信分析后發(fā)現(xiàn)DANCR可調(diào)節(jié)多個(gè)與BMSC相關(guān)的 miRNA，其中miR-1301-3p在BMSC成骨分化的過程中逐漸上調(diào)。此外，PROX1蛋白表達(dá)水平在BMSC成骨分化的過程中逐漸降低，實(shí)驗(yàn)表明DANCR在BMSC中起到了海綿吸附miR-1301-3p的作用。生信分析發(fā)現(xiàn)PROX1 mRNA可能是miR-1301-3p的靶標(biāo)。DANCR過表達(dá)后增加了BMSC中PROX1蛋白表達(dá)水平，降低了ALP、Runx2和Osx等成骨標(biāo)志物的水平，抑制了BMSC的成骨分化，但過表達(dá)miR-1301-3p可以逆轉(zhuǎn)這種效果，表明上調(diào)DANCR可以通過miR-1301-3p/PROX1軸抑制BMSC的成骨分化[36]。

3.4 調(diào)控EZH2和FOXO1影響成骨分化

EZH2和Fork box轉(zhuǎn)錄因子1(FOXO1)是DANCR的直接結(jié)合靶點(diǎn)。EZH2是參與轉(zhuǎn)錄抑制的轉(zhuǎn)錄因子，為影響B(tài)MSC成骨分化的關(guān)鍵因素[37]。在小鼠模型中，EZH2可通過作用于周期蛋白依賴性激酶抑制因子2A(cyclin-dependent kinase inhibitor 2A，CDKN2A)控制成骨過程中的骨形成和細(xì)胞周期[38]。FOXO1可通過減少氧化應(yīng)激和凋亡來恢復(fù)OB的分化和功能[39]。DANCR在PMOP小鼠體內(nèi)的表達(dá)升高，沉默DANCR后EZH2下調(diào)，而Runx2上調(diào)，同時(shí)增加了ALP活性和鈣沉積。DANCR能夠作為轉(zhuǎn)錄輔助因子將EZH2招募到Runx2基因啟動(dòng)子上，通過抑制Runx2基因的表達(dá)進(jìn)而抑制OB分化。此外，沉默DANCR可以促進(jìn)PMOP的OB增殖分化以及骨樣細(xì)胞的形成[40]；在人胎兒成骨細(xì)胞系hFOB1.19中，下調(diào)DANCR后同樣發(fā)現(xiàn)Runx2基因的表達(dá)增加并促進(jìn)了成骨分化[41]。FOXO1同樣可與Runx2啟動(dòng)子相互作用以促進(jìn)成骨分化[42]。FOXO1水平在BMSC成骨分化過程中逐漸上升，用RNA結(jié)合蛋白免疫實(shí)驗(yàn)檢測DANCR與FOXO1的關(guān)聯(lián)性表明DANCR可與FOXO1直接結(jié)合。泛素化檢測結(jié)果表明，降低DANCR 基因表達(dá)可抑制S期激酶關(guān)聯(lián)蛋白2(S-phase kinase-associated protein 2，skp2)介導(dǎo)的FOXO1泛素化，導(dǎo)致Runx2表達(dá)水平下降從而抑制BMSC成骨分化[43]。

3.5 調(diào)控其他間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化

DANCR調(diào)控成骨分化的領(lǐng)域十分廣泛，除了BMSC，還可以調(diào)控多種干細(xì)胞成骨分化。如通過海綿吸附miR-1275調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶-13(matrix metalloproteinase-13，MMP-13)的表達(dá)，參與滑液來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的軟骨分化[44]。此外，DANCR是(SRY-related HMG-box 4，Sox4)的靶分子，Sox4可直接與編碼DANCR基因的啟動(dòng)子結(jié)合并增加其表達(dá)，促進(jìn) SMSC軟骨分化，增加軟骨生成[45]。黃韌帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(ligamentum flavum derived mesenchymal stem cells，LF-MSC)參與了黃韌帶鈣化的發(fā)生，可以增加黃韌帶中軟骨細(xì)胞含量和鈣沉積。DANCR表達(dá)水平下調(diào)可導(dǎo)致黃韌帶細(xì)胞增殖減少，但增強(qiáng)了LF-MSC的軟骨分化和鈣化[46]。下調(diào)DANCR可通過激活經(jīng)典的Wnt信號通路促進(jìn)PDLSC成骨分化[47]。上調(diào)DANCR可通過海綿吸附miRNA-758靶向抑制Notch2-Wnt/β-catenin信號通路，進(jìn)而抑制PDLSC的成骨分化[12]。一項(xiàng)旨在評價(jià)PDLSC中DANCR水平表達(dá)的研究表明，降低DANCR可減少壓縮力通過OC形成和牙根吸收[48]。另一項(xiàng)研究指出創(chuàng)傷性壓應(yīng)力可以抑制MC3T3-E1成骨細(xì)胞系上DANCR的表達(dá)，從而激活NF-κB信號通路，最終導(dǎo)致成骨分化的抑制，與之前的結(jié)論存在分歧，該研究者推測這種差異可能與DANCR在不同物種中的不同生物學(xué)功能有關(guān)[49]。

4 DANCR是OP潛在的診斷及治療靶點(diǎn)

DANCR可以調(diào)控成骨分化的證據(jù)不僅存在于分子實(shí)驗(yàn)，在臨床論證中也有相關(guān)性數(shù)據(jù)，表明其可能具有作為臨床診斷指標(biāo)和治療新靶點(diǎn)的潛在價(jià)值。一項(xiàng)研究取30例PMOP婦女和20例非PMOP婦女的骨髓標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)PMOP組BMSC中DANCR水平高表達(dá)[24]。另一項(xiàng)研究取了44例骨折患者和24名健康體檢者的血清標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)骨折患者血清中DANCR高表達(dá)[25]。此外，DANCR在循環(huán)單核細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，在OP患者中增加其骨吸收活性，被確定為PMOP的潛在生物標(biāo)志物[50]。隨著醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)不斷進(jìn)步，或可通過檢測血液、骨髓等標(biāo)本中DANCR水平診斷OP。

芝麻素是一種從花椒植物中分離而來的木脂素，是芝麻油中的一種常見成分(約含0.25%)。天然芝麻素為右旋體，芝麻素也可通過人工合成，有作為藥物量產(chǎn)的潛力，具有較高的醫(yī)用價(jià)值[51]。芝麻素既可通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號通路影響細(xì)胞凋亡，也可通過調(diào)節(jié)MAPK、Wnt/βcatenin等信號通路促進(jìn) BMSC成骨分化，同時(shí)可通過抑制NF-κB通路抑制OC生成，在OP、OA及激素性股骨頭壞死等骨科疾病中起到重要的作用[52-54]。OVX小鼠血清中DANCR水平升高，芝麻素治療后OVX小鼠股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨顯微結(jié)構(gòu)明顯改善，且OVX引起升高的血清DANCR水平也被降低。DANCR是芝麻素介導(dǎo)的骨形成和吸收的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，芝麻素可通過下調(diào)DANCR表達(dá)激活Wnt/β-catenin信號通路，進(jìn)一步促進(jìn)成骨分化；也可通過抑制IκBα磷酸化和NF-κBp65核易位抑制NF-κB信號通路，從而抑制破骨細(xì)胞的形成，表明芝麻素以一種DANCR依賴的方式在OB激活和OC細(xì)胞失活中發(fā)揮雙重功能作用，且DNACR可能具有作為OP治療靶點(diǎn)潛力[55]。

5 總結(jié)和展望

OP是一種常見的全身性骨骼疾病，主要特征是骨組織微結(jié)構(gòu)損壞和骨量減少，進(jìn)而引起骨脆性及骨折風(fēng)險(xiǎn)的增加，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。BMSC移植及靶向治療是OP的熱門研究方向。DNACR既可以通過影響Wnt/β-catenin、MAPK等信號通路以及作用于多種轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)BMSC成骨分化，又可以通過抑制NF-κB信號通路從而抑制破骨細(xì)胞形成，通過維持骨代謝平衡參與OP進(jìn)程。整體來看，DANCR在BMSC的成骨分化過程中起到負(fù)向調(diào)控的作用，從臨床樣本實(shí)驗(yàn)來看，DANCR具有作為OP診斷標(biāo)志物的潛在能力，同時(shí)有望在未來參與靶點(diǎn)藥物治療OP的精準(zhǔn)醫(yī)療。然而，由于DANCR在疾病和組織中表達(dá)具有廣泛性，在臨床診斷和治療中特異性較低，且有關(guān)DNACR與OP的研究尚處于起步階段，具體調(diào)控通路交互復(fù)雜，尚有諸多問題有待進(jìn)一步探討。