祁亮 莫亮 衛(wèi)楊文祥 龐智暉

廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405

越來越多的證據(jù)[1-2]表明血管系統(tǒng)疾病和骨代謝相關(guān)，有學(xué)者提出“骨-血管軸”這一概念，認(rèn)為骨組織和血管系統(tǒng)之間存在雙向流動(dòng)的細(xì)胞、內(nèi)分泌和代謝因子等信號，可以雙向調(diào)控骨和血管代謝。當(dāng)骨-血管軸平衡被擾亂時(shí)，骨骼和血管系統(tǒng)疾病會(huì)同時(shí)發(fā)生。骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis, OP)和動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)是臨床上常見的骨骼和血管系統(tǒng)疾病，并常常同時(shí)出現(xiàn)[3]。大量研究[4]表明OP和AS之間存在直接聯(lián)系，骨密度和動(dòng)脈硬化程度呈負(fù)相關(guān)，然而對其具體的分子機(jī)制目前仍知之甚少。因此，本研究擬通過生物信息學(xué)整合OP及AS的基因數(shù)據(jù)，從分子層面闡述OP和AS間的相互影響機(jī)制，并基于中醫(yī)學(xué)“異病同治”思想，在已知二者共同機(jī)制的前提下，嘗試基于二者共同基因的關(guān)鍵靶點(diǎn)，篩選具有防治作用的中藥，以期為后續(xù)臨床應(yīng)用及實(shí)驗(yàn)研究提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 疾病靶點(diǎn)獲取

分別以骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis)和動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis)為關(guān)鍵詞在疾病數(shù)據(jù)庫GeneCards(https://genealacart.genecards.org)、DISEASES (https://diseases.jensenlab.org/) 和CTD (http://ctdbase.org/)中獲得疾病相關(guān)靶點(diǎn)。通過韋恩圖分別對三個(gè)數(shù)據(jù)庫獲得的疾病靶點(diǎn)取交集，再將兩組疾病靶點(diǎn)映射獲得OP和AS的共同疾病靶點(diǎn)。

1.2 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)的篩選

將取得的共同疾病基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)[5]，限定物種為“Homo sapiens”,置信度(confidence score)≥0.4，得到相應(yīng)數(shù)據(jù)，并使用Cytoscape軟件[6]構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction network，PPI網(wǎng)絡(luò))。通過使用Cytoscape的cytoHubba插件來識(shí)別關(guān)鍵基因。分別使用八種常用算法(MCC、 MNC、 Degree、Closeness、Radiality、 Stress、 EPC、 Betweenness)獲取排名前20的基因，再通過韋恩圖獲得關(guān)鍵基因。

1.3 功能富集分析

為了探討OP和AS共同基因的潛在作用，應(yīng)用Metascape在線網(wǎng)站[7](http://metascape.org/)對疾病基因進(jìn)行GO(gene ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)功能富集分析。P<0.01被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,并通過在線繪圖網(wǎng)站(http://www.bioinformatics.com.cn/)繪制氣泡圖展示排名靠前通路。

1.4 中藥篩選

將“1.2”項(xiàng)下獲得的關(guān)鍵基因作為預(yù)測靶標(biāo)，在醫(yī)學(xué)本體信息檢索數(shù)據(jù)庫(Coremine Medical)中按照P<0.05且藥物被《中華人民共和國藥典》收錄條件，篩選對關(guān)鍵基因具有生物學(xué)的中藥。

2 結(jié)果

2.1 疾病共同靶點(diǎn)

利用GeneCards、DISEASES和CTD數(shù)據(jù)庫收集OP和AS相關(guān)疾病靶點(diǎn)，通過韋恩圖取交集，最終獲得OP相關(guān)靶點(diǎn)315個(gè)(圖1A)、AS相關(guān)靶點(diǎn)481個(gè)(圖1B)、OP和AS共同靶點(diǎn)202個(gè)(圖1C)，表明二者之間存在大量共同基因，在發(fā)病機(jī)制上具有相通性。共同靶基因列表見表1。

圖1 OP及AS的疾病靶點(diǎn)韋恩圖Fig.1 Venn diagram of OP and AS related gene targets注：A：OP相關(guān)靶點(diǎn)；B：AS相關(guān)靶點(diǎn)；C：OP和AS共同靶點(diǎn)。

表1 OP和AS的共同靶基因列表Table 1 The list of the common target genes of OP and AS

2.2 靶基因功能富集分析

通過Metascape在線網(wǎng)站對靶基因進(jìn)行功能富集分析，以P<0.01為篩選條件并按P值從小到大排列。其中OP和AS 各自的KEGG通路富集分析結(jié)果見表2。通過氣泡圖展示OP和AS共同靶基因KEGG富集分析P值排名前15位的結(jié)果，主要涉及通路有細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相關(guān)作用、PI3K-Akt信號通路、Th1和Th2細(xì)胞分化、Th17細(xì)胞分化、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化和MAPK信號通路等(圖2A)。將GO富集分析得到生物過程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)、細(xì)胞組分(Cellular Component，CC)富集結(jié)果P值排名前5位的通過氣泡圖展示(圖2B)。發(fā)現(xiàn)共同靶基因的生物過程主要涉及對激素的反應(yīng)、對細(xì)胞因子的反應(yīng)、對肽的反應(yīng)和細(xì)胞對脂質(zhì)的反應(yīng)；其影響的分子功能主要定位在受體-配體活性、信號受體激活劑活性、細(xì)胞因子活性和生長因子活性；參與了囊腔、細(xì)胞外基質(zhì)、分泌顆粒腔和胞質(zhì)囊腔等細(xì)胞組分。

表2 OP和AS各自靶點(diǎn)KEGG通路富集分析結(jié)果Table 2 The list of KEGG pathway analysis results of OP and AS, respectively

圖2 OP和AS共同靶基因功能富集分析Fig.2 Enrichment analysis of common gene targets between OP and AS注：A：KEGG富集分析結(jié)果；B：GO富集分析結(jié)果。

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵基因篩選

將202個(gè)疾病共同靶基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫，獲得200個(gè)靶蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)，共1 697條邊(圖3A)。CytoHubba是cytoscape軟件用于識(shí)別關(guān)鍵基因的插件，提供了12種分析算法來計(jì)算PPI網(wǎng)絡(luò)圖中的關(guān)鍵基因。利用其中八種算法(MCC、 MNC、 Degree、Closeness、Radiality、 Stress、 EPC、 Betweenness)篩選出10個(gè)重疊的關(guān)鍵基因，分別為CD4、 TLR2、 TIMP1、 CCL2、 APOE、 GAPDH、 NFKBIA、 IL4、CRP和TGFB1(圖3B和圖3C)，關(guān)鍵基因信息及注釋見表3。

圖3 OP-AS共同靶基因PPI網(wǎng)絡(luò)及關(guān)鍵基因篩選Fig.3 PPI network of common gene targets between OP and AS and the screening of hub gene targets注：A:共同靶基因PPI網(wǎng)絡(luò)；B:八種算法的韋恩圖；C:關(guān)鍵基因PPI網(wǎng)絡(luò)。

表3 關(guān)鍵基因信息表Table 3 The information sheet of hub genes

2.4 OP-AS異病同治的中藥分析

將獲得的10個(gè)關(guān)鍵基因?qū)隒oremine Medical數(shù)據(jù)庫，經(jīng)篩選獲得9味與關(guān)鍵基因相關(guān)的中藥，包括黃芩(P=0.005 46)、人參花(P=0.006 78)、人參蘆(P=0.006 79)、人參葉(P=0.006 79)、人參(P=0.006 83)、丹參(P=0.011 1)、三七(P=0.015 5)、三七葉(P=0.016 1)和三七花(P=0.016 1)。

篩選出的9味中藥中，人參花、人參蘆、人參葉和人參同屬五加科人參不同藥用部分，其根莖部分(人參)在臨床上應(yīng)用最廣。三七葉、三七花和三七同屬五加科三七不同藥用部分，其根莖部分(三七)在臨床上應(yīng)用也最廣范。因此，檢索了黃芩、人參、丹參和三七四味中藥在防治OP或AS上的相關(guān)研究(表4)，結(jié)果表明它們在單病種上的防治作用已被證實(shí)，需進(jìn)一步研究其在OP-AS共病中的干預(yù)作用。

3 討論

有研究[27]指出全身免疫和炎癥反應(yīng)可能是加速動(dòng)脈斑塊形成和骨吸收的主要驅(qū)動(dòng)因素。本研究發(fā)現(xiàn)共同靶基因大量富集在輔助性T細(xì)胞(Th1、Th2和Th17)分化及炎癥因子TGF-β和白細(xì)胞介素(IL)-17通路上。T細(xì)胞是核因子κB受體活化因子配體(RANKL)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的主要來源。當(dāng)機(jī)體發(fā)生免疫反應(yīng)時(shí)，活化的T細(xì)胞過表達(dá)RANKL和炎癥因子誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成引起骨丟失[28]。AS是一種大中型動(dòng)脈的慢性炎癥性疾病，和免疫、炎癥反應(yīng)關(guān)系密切[29]。研究表明T細(xì)胞中CD4+T細(xì)胞(包括Th1、 Th2、Th17和調(diào)節(jié)T細(xì)胞)相較于CD8+T細(xì)胞與AS關(guān)系更為密切[30]，其中Th1細(xì)胞通過分泌炎癥因子(IL-2、IL-3和TNF-α)促進(jìn)AS的形成并且是斑塊中最主要的Th亞型[31]。靶向抑制T細(xì)胞增殖和Th1因子的產(chǎn)生可減少AS病變內(nèi)的T細(xì)胞浸潤，從而延緩病變發(fā)展[32]，然而尚無研究表明控制炎癥反應(yīng)可同時(shí)干預(yù)OP和AS的進(jìn)展。脂質(zhì)代謝通路也被顯著富集，與其相關(guān)的血脂異常已被大量研究證實(shí)是OP和AS共有的危險(xiǎn)因素[33]，血清膽固醇和低密度脂蛋白升高在導(dǎo)致動(dòng)脈斑塊形成的同時(shí)會(huì)抑制成骨細(xì)胞分化[34]。氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)可促進(jìn)泡沫細(xì)胞生成，同時(shí)可激活Wnt /β-catenin等通路，促進(jìn)鈣化因子和血管平滑肌細(xì)胞成骨性轉(zhuǎn)化，啟動(dòng)和促進(jìn)骨組織血管鈣化進(jìn)程，加速OP和AS病程[35]。此外，PI3K-Akt和MAPK信號通路也被顯著富集。PI3K-Akt通路與炎癥反應(yīng)關(guān)系密切，其通過抗骨細(xì)胞凋亡與OP相關(guān)聯(lián)[36]，同時(shí)與AS斑塊中巨噬細(xì)胞自噬引起的炎癥相關(guān)[37]。激活PI3K-Akt通路可以保護(hù)骨小梁結(jié)構(gòu)，下調(diào)破骨細(xì)胞分化[38]，同時(shí)降低ApoE-/-小鼠血脂水平并穩(wěn)定易損斑塊[41]。MAPK通路是調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞代謝的主要通路，JUK和p38的磷酸化是破骨細(xì)胞分化和增殖的關(guān)鍵因素[40]，其同時(shí)又參與了內(nèi)皮細(xì)胞激活、誘導(dǎo)炎性因子分泌和黏附分子聚集，與AS的病理進(jìn)展關(guān)系密切[41]。研究證實(shí)抑制MAPK信號通路可延緩OP[42]或AS[43]疾病的進(jìn)展，但目前尚無研究表明二者可同時(shí)從MAPK抑制劑中獲益。

獲得的10個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)中，如表3所示，大部分靶點(diǎn)與免疫炎癥反應(yīng)關(guān)系密切，值得一提的是TIMP1和APOE基因在共病機(jī)制中的作用。TIMP1屬于基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)活性抑制劑，MMP與破骨細(xì)胞活性增加相關(guān)[44]，同時(shí)其在粥樣硬化斑塊中的表達(dá)水平也明顯升高[45]。最新研究發(fā)現(xiàn)MMP-9與血脂異常標(biāo)志物及骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物顯著相關(guān)，可作為OP-AS疾病偶聯(lián)的關(guān)鍵因子[48]。而MMP的活性受TIMP1的調(diào)節(jié)，TIMP1基因缺陷小鼠AS病變進(jìn)展加快[47]，激活TIMP1的表達(dá)可抑制雌激素缺乏誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡[48]。APOE基因主要編碼載脂蛋白E，與人體血脂代謝關(guān)系密切，ApoE(-/-)小鼠常用于制備AS動(dòng)物模型[49]，同時(shí)APOE可通過調(diào)節(jié)骨鈣素羧化和Wnt信號通路影響骨代謝[50]。因此調(diào)控TIMP1和APOE有望成為未來干預(yù)OP-AS共病的新靶點(diǎn)。綜上所述，不難看出OP和AS之間存在密切聯(lián)系，涉及免疫炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)代謝、PI3K-Akt和MAPK等相關(guān)通路及TIMP1和APOE等核心靶點(diǎn)，然而很少有學(xué)者研究相關(guān)通路或靶點(diǎn)對OP和AS的共同影響，本研究為OP和AS共同機(jī)制及靶點(diǎn)的挖掘提供了一定的線索。

OP屬于祖國醫(yī)學(xué)中“萎證”范疇，病變在骨，其本在腎；AS屬于“脈痹”范疇，病變涉及心、腦、腎及全身脈管。中醫(yī)認(rèn)為二者共同病因病機(jī)主要涉及絡(luò)脈病變、血液濁化和心腎不交三個(gè)方面[51]。心主血脈，五行屬火，腎主骨，五行屬水?！独硖撛b》載記: “心腎不交….體倦骨痿”。心(血脈)與腎(骨)的功能互相影響，這一理念即符合中醫(yī)整體觀念，又與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)“骨-血管軸”這一概念不謀而和?！爱惒⊥巍笔侵嗅t(yī)學(xué)整體觀念的體現(xiàn)，鑒于OP和AS在基因?qū)用婕爸嗅t(yī)病機(jī)上具有廣泛相通性，嘗試通過二者之間的關(guān)鍵基因預(yù)測異病同治相關(guān)中藥。

根據(jù)預(yù)測結(jié)果，共獲得9味中藥，都?xì)w屬于活血化瘀藥及補(bǔ)虛藥兩類，符合二者虛實(shí)夾雜的病機(jī)。其中人參花、人參蘆、人參葉、三七花和三七葉在臨床上較少使用，關(guān)于其活性成分及功效的研究亦較少，因此本研究重點(diǎn)探討了另外四味中藥及其活性成分對OP和AS的防治作用。目前臨床上常用的他汀類藥物在調(diào)節(jié)血脂、防止斑塊形成同時(shí)，對增加骨密度、減少骨折也有積極影響，但一定程度上對骨髓干細(xì)胞產(chǎn)生不良影響[52]。最新研究發(fā)現(xiàn)丹參可通過調(diào)節(jié)骨代謝和血脂水平，同時(shí)干預(yù)OP和AS的進(jìn)展，然而并未揭示其具體分子機(jī)制[53]。本研究通過檢索文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)大量研究證實(shí)了黃芩、人參、丹參和三七四味中藥對OP和AS的干預(yù)作用，然而具體的藥物活性成分有所差異。中藥具有“多成分、多靶點(diǎn)”特點(diǎn)，藥理作用廣泛，探討同一味中藥或不同中藥組成的復(fù)方對OP和AS的共同干預(yù)作用及同一活性成分對OP和AS的共同干預(yù)作用、明確藥物的作用機(jī)制將是本團(tuán)隊(duì)未來研究的重點(diǎn)。