常裕紳 朱亮亮 匡浩銘 院一蔚 葉子豐 鐘秀遠(yuǎn) 陳小明 匡建軍

1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208 2. 湖南省中醫(yī)藥研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410006 3. 湖南中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，湖南 株洲 412012

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)是絕經(jīng)后女性好發(fā)的一種代謝性骨病。卵巢功能衰退引起體內(nèi)雌激素分泌減少，對(duì)整體代謝系統(tǒng)產(chǎn)生影響，其發(fā)病特點(diǎn)是骨吸收大于骨生成、骨微結(jié)構(gòu)破壞、骨量減少、骨脆性增加[1]，使得絕經(jīng)期女性發(fā)生骨折的概率大大增加，對(duì)生命健康帶來(lái)了嚴(yán)重影響。祖國(guó)醫(yī)學(xué)根據(jù)“腎主骨”理論辯證骨質(zhì)疏松癥主要為腎虛精虧，臨床上常以補(bǔ)腎益精為治法?！敖饎偼琛弊钤缬涊d于金·劉完素《素問(wèn)病機(jī)氣宜保命集》，由中藥肉蓯蓉、綿萆薢、菟絲子、杜仲和豬腰子煉制而成，是補(bǔ)腎強(qiáng)筋壯骨的經(jīng)典名方。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[2]表明金剛丸通過(guò)提高雌激素水平調(diào)節(jié)骨代謝提高骨密度，降低炎性因子對(duì)絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路的影響抑制骨破壞[3]，從而防治骨質(zhì)疏松癥。然而金剛丸治療PMOP 的具體機(jī)制尚未明確，限制了其在臨床的進(jìn)一步推廣與運(yùn)用。

代謝組學(xué)通過(guò)分析微觀代謝物的變化繼而了解復(fù)雜疾病過(guò)程，廣泛用于評(píng)價(jià)治療效果和剖析天然產(chǎn)物的潛在機(jī)制[4]，因其全面、系統(tǒng)的分析特點(diǎn)與中醫(yī)的整體、辨證的觀念相契合，能為從中醫(yī)藥層面探索PMOP的防治提供新的思維和實(shí)踐。氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)是一種高適用性的代謝組學(xué)分析方法，穩(wěn)定性好及分離率高，在復(fù)雜基質(zhì)的分析方面具有明顯優(yōu)勢(shì)[5]。本研究在前期金剛丸研究基礎(chǔ)上嘗試運(yùn)用GC-MS技術(shù)探討金剛丸治療PMOP的代謝機(jī)制，以期將結(jié)果應(yīng)用于后續(xù)的臨床研究中。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)藥物：金剛丸(陜西天洋制藥有限責(zé)任公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字：Z61020726，規(guī)格：6×9 g/袋/盒)；戊酸雌二醇片(法國(guó)DELPHARM Lille S.A.S．生產(chǎn)，進(jìn)口藥品注冊(cè)證號(hào)H20080108；規(guī)格：1 mg×21片/盒)。

1.1.2主要儀器與試劑：顯微鏡(Motic BA210 T)；雙能X線骨密度儀(MEDILINK公司 MEDIX-90)；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析儀(日本島津 REX2000)、毛細(xì)管氣象色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm，北京譜合 HP-5 MS)；高速冷凍離心儀(湖南湘儀 H1650R)；生物樣品均質(zhì)儀(中國(guó)杭州奧盛 Bioprep-24)。吡啶、甲氧胺鹽酸鹽(上海至吉生化科技有限公司)；BSTFA+1%TMCS(99∶1)(ThermoFisher公司)；甲醇、乙腈、丙酮、正庚烷(上?？泼鸦瘜W(xué)科技有限公司)，蒸餾水。

1.1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：39只成年未經(jīng)產(chǎn)6月齡SD雌性大鼠，體重(280±30)g [購(gòu)于湖南省中醫(yī)藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(湘)2019-0004]。飼養(yǎng)條件：(25±2)℃，相對(duì)濕度50 %～60 %，12 h光/12 h暗循環(huán)，標(biāo)準(zhǔn)營(yíng)養(yǎng)顆粒飼料和飲水充足。本實(shí)驗(yàn)得到湖南省中醫(yī)藥研究院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，倫理號(hào)：2020-0065。

1.2 方法

1.2.1PMOP模型的建立：采用國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的雌性大鼠 PMOP 模型[5]。將39只大鼠常規(guī)飼養(yǎng)一周適應(yīng)環(huán)境，按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為3組，空白組(Blank，n=9)、假手術(shù)組(Sham，n= 9)、造模組(n=21)；除Blank組以外的30只大鼠進(jìn)行手術(shù)處理，Blank組不做處理。術(shù)前注射10 %水合氯醛溶液麻醉(0.2 mL/100 g體質(zhì)量)，無(wú)菌操作下摘除大鼠雙側(cè)卵巢，Sham 組則只切除卵巢附近等體積的脂肪，術(shù)后縫皮封口，連續(xù)3 d通過(guò)大腿部位肌注青霉素鈉預(yù)防傷口感染，每只大鼠5萬(wàn)U/d。每組處死3只大鼠驗(yàn)證模型。

1.2.2動(dòng)物分組及給藥：造模成功后，將造模組剩下的18只大鼠再按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組(OVX，n=6)、金剛丸組(JGW，n=6)、戊酸雌二醇組(E2，n=6)。造模后1周開始給藥，參照標(biāo)準(zhǔn)的人與實(shí)驗(yàn)大鼠等效劑量換算[6]，金剛丸水溶液含金剛丸生藥3.6 g/kg，濃度為0.36 g/mL，戊酸雌二醇水溶液含戊酸雌二醇生藥9 mg/kg，濃度為0.009 g/mL，灌胃給藥每日1次，其他三組(空白組、假手術(shù)組、模型組)則分別根據(jù)大鼠體質(zhì)量灌胃同體積蒸餾水1 mL/100 g，每日1次，每周稱重。

1.2.3樣本的收集與制備：各組實(shí)驗(yàn)大鼠給藥12周后取材，每只大鼠以10 %水合氯醛溶液麻醉后取腹主動(dòng)脈血5 mL、腰椎椎體及右側(cè)股骨備用；代謝物提取[7]：取150 μL血清樣品解凍，加入甲醇、乙腈和丙酮的等比例混合溶液800 μL 渦旋1 min，震蕩混勻5 min，冰浴超聲10 min，離心10 min(10 000 r/min)，移液管吸取800 μL上清液于上樣瓶中，常溫下氮?dú)庹舭l(fā)至干燥；樣品衍生化：加入75 μL 甲氧胺吡啶溶液混勻5 min，70 ℃條件下(300 r/min)震蕩 1 h 后，冷卻至室溫，加入BSTFA+1%TMCS溶液75 μL，室溫(300 r/min)震蕩1 h，加入150 μL終止溶劑正庚烷(含0.1 g/L二十二烷)，前處理完成后，取上清液于進(jìn)樣管，進(jìn)行GC-MS分析。

1.2.4H&E染色法觀察大鼠股骨組織結(jié)構(gòu)：取大鼠右側(cè)股骨中段1 cm，刮出多余肌肉組織，用4 %多聚甲醛固定，10 % EDTA溶液脫鈣，切片置于二甲苯中，梯度乙醇脫水，骨組織塊浸蠟、包埋，冷卻后切片機(jī)切片，加熱燙平，60 ℃恒溫機(jī)烘干，二甲苯脫蠟，蘇木素伊紅染色10 min，每次蒸餾水沖洗，烘干后中性樹膠封片，顯微鏡觀察骨小梁結(jié)構(gòu)。

1.2.5指標(biāo)測(cè)定：通過(guò)雙能X線骨密度儀測(cè)定大鼠腰椎椎體BMD值。骨代謝指標(biāo)ALP、OCN、TRAP 5b均采用ELISE法按照試劑盒說(shuō)明書測(cè)定。血脂指標(biāo)TC、TG、LDL-C、HDL-C均采用全自動(dòng)生化分析儀按照試劑盒說(shuō)明書測(cè)定。

1.2.6色譜、質(zhì)譜條件：色譜條件：毛細(xì)管柱HP-5 MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度：270 ℃；升溫程序：初始85 ℃(持續(xù)5 min)，以 10 ℃/min 升至 300 ℃(持續(xù) 10 min)；進(jìn)樣量2.0 μL(不分流)；載氣：99.99 %高純氦氣，流速為 1.0 mL/min；溶劑延遲 5 min。質(zhì)譜條件：接口溫度：280 ℃；離子源溫度：230 ℃；四級(jí)桿溫度 150 ℃；電離方式：EI；電離能量 70 eV；電子倍增器電壓：1753 V；掃描方式：全掃描60～600 m/z。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 H&E染色結(jié)果

與Blank組、Sham組相比，去卵巢后大鼠骨小梁出現(xiàn)明顯斷裂、形態(tài)模糊，骨髓腔間隙顯著增加，大量部位被脂肪細(xì)胞所代替，而金剛丸治療后的大鼠則觀察骨小梁結(jié)構(gòu)明顯改善，且脂肪細(xì)胞重新被骨小梁所代替。見圖1。

圖1 各組大鼠骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)(10×10)Fig.1 Morphological structure of bone tissue of rats in each group(10×10)

2.2 各組大鼠腰椎BMD、血清ALP、OCN、TRAP5b水平變化

Blank組、Sham組BMD水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與Sham組比較，OVX組BMD明顯降低(P<0.05)；與OVX組比較，JGW組和E2組BMD水平明顯升高(P<0.05)。與Sham組比較，OVX組ALP、OCN、TRAP5b水平升高(P<0.05或P<0.01)；與OVX組比較，JGW組和E2組血清中ALP、OCN、TRAP5b水平均降低(P<0.05或P<0.01)。見圖2。

圖2 各組大鼠骨密度及骨代謝指標(biāo)水平比較Fig.2 Comparison of BMD and bone metabolism index levels of rats in each group注: 與Sham組大鼠比較，#P>0. 05；與OVX組大鼠比較，*P<0. 05，**P<0. 01。

2.3 各組大鼠血脂水平變化

與Sham組比較，OVX組大鼠血清TC、TG、LDL-C水平明顯升高，HDL-C水平明顯降低(P<0. 05)；與OVX組比較，JGW組和E2組血清中TC、TG、LDL-C水平均降低(P<0.05)，HDL-C水平升高(P<0.05)。見圖3。

圖3 各組大鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C含量比較Fig.3 Comparison of TC, TG, LDL-C, HDL-C contents in serum of rats in each group注: 與Sham組大鼠比較，#P>0. 05；與OVX組大鼠比較，*P<0. 05。

2.4 基于GC-MS的大鼠血清代謝組學(xué)檢測(cè)

通過(guò)GC-MS分析后展示各組大鼠血清樣本典型總離子流色譜圖(圖4)，利用NIST標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)庫(kù)，鑒定出的大鼠內(nèi)源性代謝產(chǎn)物主要分為氨基酸類、糖類、脂類及其他小分子代謝產(chǎn)物。綜合結(jié)果來(lái)觀察，各組大鼠代謝物輪廓基本類似，但代謝物水平之間差異較大。

圖4 各組大鼠血清總離子流色譜圖Fig.4 Total ion chromatogram of rat serum in each group注：A：空白組；B：假手術(shù)組；C：模型組；D：金剛丸組；E：戊酸雌二醇組；1：草酸；2：乳酸；3：R-3-羥基丁酸；4：尿素；5：脯氨酸；6：甘露糖；7：葡萄糖；8：半乳糖；9：肌醇；10：油酸；11：十八碳二烯酸；12：花生四烯酸；13：膽固醇。

2.5 主要代謝物分析

PCA是一種采用數(shù)據(jù)降維算法可在二維或多維空間反應(yīng)樣本間總體分布。如圖5所示，在PCA分?jǐn)?shù)圖中，基于樣本之間的相似性對(duì)樣本進(jìn)行分組，可直觀的看到各組大鼠的代謝表型均有一定的區(qū)分。

圖5 各組大鼠血清PCA得分圖Fig.5 Serum PCA scores plot of rats in each group注：A：空白組；B：假手術(shù)組；C：模型組；D：金剛丸組；E：戊酸雌二醇組。

2.6 差異代謝生物標(biāo)志物篩選及分析

將Sham組與OVX組大鼠的歸一化數(shù)據(jù)進(jìn)行組間OPLS-DA，見圖6，可見Sham組與OVX組分離明顯，分別置于得分圖兩側(cè)，組間差異遠(yuǎn)大于組內(nèi)差異，說(shuō)明該模型的區(qū)分程度較好，并以R2X=0.86，R2Y=0.999，Q2=0.996參數(shù)評(píng)判該模型質(zhì)量較為可靠，見圖7。根據(jù)VIP(VIP>1.0)、P(P<0.05)且經(jīng)t檢驗(yàn)，最終篩選得到具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的13個(gè)差異生物標(biāo)志物。進(jìn)一步比較，其中OVX組大鼠較Sham組有5個(gè)代謝物表達(dá)水平明顯上升，8個(gè)代謝物顯著下降。對(duì)比OVX組與JGW組，經(jīng)金剛丸治療后的去卵巢大鼠體內(nèi)5個(gè)代謝物表達(dá)上升，4個(gè)代謝物表達(dá)下降，4個(gè)變化不明顯，見表1。并通過(guò)熱圖比較Sham、OVX、JGW、E2各組差異代謝標(biāo)志物的表達(dá)情況，見圖8。

圖6 Sham組與OVX組大鼠血清OPLS-DA得分圖Fig.6 OPLS-DA score plot of serum in Sham group and OVX group注：B：假手術(shù)組；C：模型組。

圖7 OPLS-DA模型的驗(yàn)證圖Fig.7 OPLS-DA validation plot of model

圖8 各組大鼠的血清代謝物熱圖Fig.8 Heatmap representation of serum metabolites of rats in each group

2.7 代謝通路富集分析

將2.6中金剛丸干預(yù)后顯著差異代謝物的HMDB號(hào)進(jìn)行代謝通路分析，發(fā)現(xiàn)impact > 0.03的5條代謝通路，見圖9及表2。

圖9 特異性生物標(biāo)志物的代謝路徑影響值得分圖Fig.9 The metabolic pathway influence value of specific biomarkers

表2 金剛丸干預(yù)去卵巢模型大鼠血清代謝通路Table 2 Jingangwan intervenes serum metabolic pathways in ovariectomized rats

3 討論

PMOP是一種高轉(zhuǎn)換代謝型骨病。在骨重建過(guò)程中，骨代謝指標(biāo)可及時(shí)反映骨轉(zhuǎn)換狀態(tài)[8]。ALP、OCN是由成骨細(xì)胞合成和分泌，與骨基質(zhì)礦化密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠 ALP、OCN 較假手術(shù)組升高，可能是由于模型組大鼠骨代謝處于高轉(zhuǎn)換狀態(tài)，成骨細(xì)胞代謝活躍所致，而金剛丸大鼠血清 ALP 、OCN含量較模型組明顯降低，提示金剛丸有改善骨代謝作用；據(jù)有關(guān)研究[9]顯示，女性ALP、OCN在絕經(jīng)期(50～59歲)顯著升高，與BMD呈負(fù)相關(guān)，這與本研究結(jié)果相符。TRACP5b是在破骨細(xì)胞中特定表達(dá)的酸性磷酸酶同功酶亞型，是一個(gè)具有特異性和高敏感度的骨吸收指標(biāo)，研究結(jié)果顯示模型組較假手術(shù)組TRACP5b升高，提示骨吸收增強(qiáng)；金剛丸對(duì)TRACP5b有下調(diào)作用，說(shuō)明金剛丸可通過(guò)影響TRACP5b抑制骨吸收。血清TC、TG、LDL-C、HDL-C均是評(píng)價(jià)心腦血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)因素，同時(shí)也反應(yīng)體內(nèi)脂質(zhì)代謝情況。模型組較假手術(shù)組TC、TG、LDL-C水平升高，HDL-C水平降低，這可能由于大鼠去卵巢后雌激素分泌減少導(dǎo)致脂代謝紊亂；經(jīng)金剛丸治療后，這些指標(biāo)也得到明顯回調(diào)，說(shuō)明金剛丸可改善骨質(zhì)疏松大鼠的脂代謝過(guò)程，同時(shí)也印證了骨-脂代謝異常失衡與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生關(guān)系密切[10]。

本次代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)了13個(gè)與PMOP有關(guān)的潛在代謝標(biāo)志物。而在這些代謝物中，金剛丸組與模型組對(duì)比發(fā)現(xiàn)有9個(gè)代謝物發(fā)生了回調(diào)，可能通過(guò)花生四烯酸代謝、肌醇磷酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝和半乳糖代謝發(fā)揮作用?；ㄉ南┧?arachidonic acid，AA)在人體內(nèi)由油酸轉(zhuǎn)化而來(lái)，其參與合成物質(zhì)具有多重生物活性[11]，游離的AA先后在環(huán)加氧酶和前列腺素合成酶的酶促代謝作用下可形成前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)，大量的研究[12]表明PGE2對(duì)骨組織生長(zhǎng)和骨折愈合以及預(yù)防骨質(zhì)疏松有明顯促進(jìn)作用。但有研究[13]認(rèn)為PGE2并不能直接促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，而是通過(guò)激活感覺神經(jīng)來(lái)維持骨代謝平衡狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)中模型組較假手術(shù)組AA水平下降，而金剛丸組較模型組AA表達(dá)水平上升，由此可推測(cè)金剛丸可能在通過(guò)調(diào)節(jié)脂代謝(尤其是不飽和脂肪酸代謝)來(lái)影響骨代謝方面發(fā)揮了重要作用。

肌醇是一種維生素類似物，其作用是與各種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)包括骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞代謝在內(nèi)的生物過(guò)程有關(guān)。磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/絲氨酸/蘇氨酸激酶(serine/threonine kinase，AKT)信號(hào)通路與骨質(zhì)疏松的發(fā)生關(guān)系緊密[14]，肌醇被脂質(zhì)激酶磷酸化后的下游產(chǎn)物磷脂酰肌醇三磷酸是作為第二信使參與調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路的。XI等[15]通過(guò)模擬骨質(zhì)疏松癥的體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt細(xì)胞信號(hào)通路可以促成骨細(xì)胞增殖、分化和誘導(dǎo)骨形成。研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血清中肌醇水平下調(diào)，提示大鼠去卵巢后可引起肌醇水平降低，而金剛丸組與模型組相比肌醇水平升高，由此可推測(cè)金剛丸防治PMOP，可能與肌醇磷酸代謝和PI3K/Akt信號(hào)通路的激活有關(guān)。

甘露糖、半乳糖、葡萄糖三種單糖都是機(jī)體所需的能量物質(zhì)。半乳糖(galactose，GA)代謝幾乎發(fā)生在肝臟中，被機(jī)體吸收的GA經(jīng)半乳糖激酶誘導(dǎo)后、在半乳糖-l-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)作用下生成二磷酸尿甘半乳糖，再經(jīng)過(guò)半乳糖-4表異構(gòu)酶的表異構(gòu)化，最后形成l-磷酸葡萄糖進(jìn)入葡萄糖代謝[16]。在調(diào)節(jié)葡萄糖能量代謝的過(guò)程中，雌激素可多角度參與相關(guān)蛋白的表達(dá)，直接或間接影響葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程、糖酵解和氧化磷酸化反應(yīng)[17]。有關(guān)研究[18]還發(fā)現(xiàn)雌激素對(duì)肝臟糖脂代謝具有保護(hù)作用。本研究中，當(dāng)模型組雌激素水平下降時(shí)，半乳糖水平顯著升高，葡萄糖水平下降，表明GA轉(zhuǎn)變成l-磷酸葡萄糖的途徑受阻，導(dǎo)致半乳糖堆積，核因子κB信號(hào)通路及核因子κ B受體活化因子配體系統(tǒng)被GA轉(zhuǎn)換的晚期糖基化終末產(chǎn)物、活性氧和自由基等物質(zhì)激活，直接導(dǎo)致炎癥反應(yīng)和破骨細(xì)胞的活化[19]。金剛丸干預(yù)后可使大鼠體內(nèi)異常的半乳糖含量回調(diào)到正常水平，由此推測(cè)這些代謝產(chǎn)物的的改變可能是金剛丸對(duì)PMOP的一種積極的保護(hù)或治療機(jī)制。從熱圖上還可發(fā)現(xiàn)模型組的(R)- 3-羥基丁酸和脯氨酸水平較假手術(shù)組下降，而金剛丸組較模型組均上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。氨基酸不僅是細(xì)胞信號(hào)分子，而且是基因表達(dá)和蛋白質(zhì)磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)的調(diào)節(jié)劑。研究表明[20]，在骨代謝方面氨基酸可以作為誘導(dǎo)骨形成和鈣的直接調(diào)節(jié)劑。

綜上所述，本研究采用GC-MS代謝組學(xué)技術(shù)進(jìn)行分析，篩選出的13種代謝差異物可能作為診斷和治療PMOP的潛在生物標(biāo)志物，并且初步探討了金剛丸改善PMOP可能與調(diào)節(jié)脂代謝、氨基酸代謝與糖代謝有關(guān)，為進(jìn)一步指導(dǎo)臨床診治提供了一定的科學(xué)依據(jù)。