蔡葉 王明飛* 張磊 王健 石繼祥 仇建軍 劉鋮祎 周旭

1. 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院，上海 200062 2. 上海市浦東新區(qū)人民醫(yī)院，上海 201200

老年性骨質(zhì)疏松(senile osteoporosis，SOP)是一種增齡相關(guān)的骨科常見病，衰老是該病的潛在危險因素。骨量低下、骨微結(jié)構(gòu)損傷使得SOP患者的骨脆性增加、骨折風(fēng)險加大[1]。SOP患者在髖部骨折后的死亡率增高，超半數(shù)髖部骨折患者的自主生活能力受到影響，嚴(yán)重影響著生活質(zhì)量[2]。SOP的治療在很大程度上依賴于抗吸收藥物，這類藥物不能恢復(fù)骨丟失，而是阻止骨吸收，可能出現(xiàn)下頜骨壞死、低鈣血癥等不良反應(yīng)[3-4]。盡管有許多具有不同藥理特性的抗SOP藥物，但仍有大量患者沒有達(dá)到靶向治療效果，且對SOP骨折的緩解效果仍然不佳。因此，尋找有效且安全的藥物仍是重要挑戰(zhàn)。淫羊藿是防治SOP的常用中藥之一，其有效成分淫羊藿苷(icarrin，Ica)有著較好的促進(jìn)成骨、抑制成脂的調(diào)節(jié)作用，應(yīng)用于絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥模型中的研究較多、效果佳，但是在SOP應(yīng)用中的影響及機(jī)制尚未完全明晰。

骨骼作為調(diào)控骨微環(huán)境動態(tài)平衡的器官，雖然受著各類激素的調(diào)節(jié)，但嚴(yán)密的協(xié)調(diào)關(guān)系同樣需要骨微環(huán)境中骨細(xì)胞的支持。BMSCs(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)作為成骨細(xì)胞的前體細(xì)胞，在骨微環(huán)境中為了應(yīng)對損傷，容易參與衰老程序，尤其是在老年時，成骨細(xì)胞為了補(bǔ)償破骨細(xì)胞骨吸收會存在骨形成不足。所以本研究假設(shè)改善衰老BMSCs狀態(tài)、保障成骨分化是治療SOP的一種可能策略，探討Ica對D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老BMSCs成骨的影響，并進(jìn)一步揭示該藥物在SOP中的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

選取SPF級4周齡SD大鼠10只。淫羊藿苷、D-半乳糖(上海融禾，純度>98%)，大鼠BMSCs完全培養(yǎng)基、成骨及成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(Cyagen)，CCK8(同仁)，SA-β-半乳糖苷酶染色盒，ALP試劑盒，RNA提取試劑盒(Vazyme)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTM。

1.2 方法

1.2.1BMSCs的分離與培養(yǎng)：通過戊巴比妥鈉麻醉大鼠，將大鼠處死后置于75%乙醇中浸泡15 min。置于超凈臺中分離股骨及脛骨，用滅菌手術(shù)剪剪去骨骺端、暴露髓腔。吸培養(yǎng)基沖洗髓腔至骨頭發(fā)白，離心管收集后1 000 r/min離心8 min。重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后首次換液，每2～3 d換液一次。細(xì)胞長至80%融合時，胰酶消化后按1∶2傳代，后續(xù)實(shí)驗(yàn)均選用第3代BMSCs。

1.2.2BMSCs的鑒定：按流式試劑盒說明書所示，重懸細(xì)胞、檢測BMSCs表面標(biāo)志物CD44、CD90、CD34、CD45；進(jìn)行成骨、成脂誘導(dǎo)分化，完成后進(jìn)行茜素紅染色及油紅O染色，鑒定所提細(xì)胞為BMSCs。

1.2.3CCK8測定：將BMSCs接種到96孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)。BMSCs融合狀況較好時，加入用無血清培養(yǎng)基配制的0、2.5、5、10、20、30、40、50、60、70 mg/mL濃度的D-gal、10-3～10-11mol/L濃度的Ica。繼續(xù)培養(yǎng)24 、48 h后，吸棄舊培養(yǎng)基，加入無血清培養(yǎng)基和CCK8，繼續(xù)培養(yǎng)2.5 h。檢測450 nm處的OD值。

1.2.4衰老BMSCs的鑒定：將BMSCs培養(yǎng)至6孔板，選用D-gal誘導(dǎo)BMSCs衰老。SA-β-半乳糖苷酶染色能將衰老BMSCs染成藍(lán)色，按說明書所示步驟進(jìn)行固定、染色等操作。在普通光鏡下觀察，隨機(jī)選取3個視野，統(tǒng)計藍(lán)色的陽性細(xì)胞數(shù)量，陽染率(%)=(陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%。

1.2.5造模與分組：為了避免細(xì)胞自身不同步的復(fù)制性衰老，采用D-gal誘導(dǎo)BMSCs進(jìn)行衰老造模。分成6個組，干預(yù)如下：(1)正常(Con)組：無處理；(2)D-半乳糖(D-gal)組：D-gal 30 mg/mL；(3)Ica高劑量(IcaH)組：Ica 10-8mol/L；(4)Ica低劑量(IcaL)組：Ica 10-10mol/L；(5)Ica高劑量+D-gal(IcaH+D-gal)組：Ica 10-8mol/L+D-gal 30 mg/mL；(6)Ica低劑量+D-gal(IcaL+D-gal)組：Ica 10-10mol/L+D-gal 30 mg/mL。

1.2.6檢測指標(biāo)與方法

1.2.6.1ALP檢測：按說明書配制酚標(biāo)準(zhǔn)液，設(shè)空白管、標(biāo)準(zhǔn)管、測定管，混勻，37 ℃水浴15 min，之后加入顯色劑混勻。轉(zhuǎn)移到96孔板中，檢測520 nm處的 OD值。公式如下：ALP活力(1金氏單位/100 mL體系)=[(OD樣品測定-OD空白)/(OD標(biāo)準(zhǔn)-OD空白)]×C酚標(biāo)準(zhǔn)×100×樣本稀釋倍數(shù)。

1.2.6.2Western Blot:PBS清洗6孔板后，加RIPA進(jìn)行裂解。收集裂解液，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，留蛋白上清液，BCA法測蛋白濃度。加入SDS-PAGE上樣緩沖液，95 ℃干浴鍋中煮8 min。配制膠板，上樣后電泳，90 V讓條帶跑至濃縮膠下緣、再調(diào)至120 V跑開。電泳完畢，調(diào)300 mA轉(zhuǎn)膜120 min。封閉，4 ℃一抗孵育過夜。清洗條帶，二抗孵育2 h。顯影，使用Image J分析。

1.2.6.3RT-PCR：取出6孔板，按說明書步驟提各孔RNA，測得濃度。進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，收集cDNA。引物序列如下，β-catenin：(F)ACAAGCCACAGGACT ACAAGAAACG；(R)TCAGCAGTCTCATTCCAAGCC ATTG。Foxo3a：(F)ACCTGCGTCACTCAACTCCC；(R)TTGGAGTGTCTGGTTGCCGT。P16：(F)GGT CACCGACAGGCATAACTTC；(R)AAAGGAGGGC TGAGGCCTAA。P21：(F)GGACTCTGAAGATGT GCCTATGGTC；(R)CCTGAGCCTGTTTCGTGTCTAC TG。P53：(F)CCTTACCATCATCACGCTGGAA GAC；(R)AGGACAGGCACAAACACGAACC。按說明書所示配制反應(yīng)體系，PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。結(jié)束后分析，2-ΔΔct進(jìn)行計算。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

圖1所示依次為原代BMSCs和第2代的BMSCs。當(dāng)細(xì)胞尚未傳代時，可見較多混雜細(xì)胞。隨著傳代過程逐漸純化，BMSCs表現(xiàn)為長梭形、多角形等形態(tài)，常呈現(xiàn)出漩渦狀或放射狀的聚集形態(tài)，混雜細(xì)胞明顯減少。

圖1 不同時間點(diǎn)的BMSCs鏡下圖(100×)Fig.1 BMSCs mirror at different time points (100×)

2.2 BMSCs的鑒定

對BMSCs的特異性表面特異性標(biāo)志物進(jìn)行流式鑒定，結(jié)果如圖2所示。CD44和CD90表達(dá)分別為99.78%和99.77%，>95%；CD34、CD45表達(dá)分別為0.66%、0.57%，< 5%，指標(biāo)符合BMSCs表面標(biāo)志物特征。

圖2 BMSCs表面不同特異性標(biāo)志物的流式細(xì)胞術(shù)鑒定結(jié)果Fig.2 Flow cytometry identification results of different specific markers on BMSCs surface

2.3 BMSCs的茜素紅染色、油紅O染色

對BMSCs進(jìn)行成骨、成脂誘導(dǎo)分化及其染色，結(jié)果如圖3所示。成骨誘導(dǎo)結(jié)束后，進(jìn)行茜素紅染色，可見被染成橘紅色的鈣結(jié)節(jié)(圖3A)；成脂誘導(dǎo)結(jié)束后，用油紅O液染色，可見被染色成橘色的球形透明脂滴(圖3B)。結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)和成骨、成脂誘導(dǎo)分化染色，可驗(yàn)證所提細(xì)胞為BMSCs。

圖3 BMSCs成骨、成脂誘導(dǎo)后對應(yīng)的茜素紅染色(A)、油紅O染色(B)Fig.3 Alizarin red staining (A) and oil red O staining (B) were performed on BMSCs after osteogenesis and lipid induction

2.4 CCK8測定

設(shè)置不同濃度梯度的D-gal及Ica處理BMSCs，分別處理24、48 h，檢測細(xì)胞增殖。如圖4、圖5所示。CCK8結(jié)果提示D-gal誘導(dǎo)細(xì)胞衰老的最適處理濃度為30 mg/mL，該濃度不影響B(tài)MSCs增殖且為D-gal不同濃度范圍內(nèi)的較高濃度；Ica干預(yù)濃度選用最適濃度范內(nèi)的10-8、10-10mol/L為處理的高、低濃度，使用這些濃度對后續(xù)實(shí)驗(yàn)中的BMSCs進(jìn)行干預(yù)48 h。

圖4 D-gal處理BMSCs不同時間的細(xì)胞增殖Fig.4 Cell proliferation of BMSCs treated with D-Gal at different times注：與Con組比較，處理24 h組別中，*P<0.05；處理48 h組別中，#P<0.05。

圖5 Ica處理BMSCs不同時間的細(xì)胞增殖Fig.5 Cell proliferation of BMSCs treated by Ica at different times注：與Con組比較，處理24 h組別中，*P<0.05，**P<0.01；處理48 h組別中，#P<0.05。

2.5 衰老BMSCs檢測

衰老BMSCs的形態(tài)變化(200×)如圖6所示，衰老BMSCs的細(xì)胞形態(tài)扁平、體積稍增大；細(xì)胞膜形狀不規(guī)整，折光度較差；細(xì)胞質(zhì)內(nèi)空泡稍增多。進(jìn)行SA-β-半乳糖苷酶染色后，鏡下(100×)可見藍(lán)色的衰老BMSCs。

圖6 衰老BMSCs的細(xì)胞形態(tài)Fig.6 Cell morphology of senescent BMSCs

對6孔板中BMSCs進(jìn)行SA-β-半乳糖苷酶染色后，統(tǒng)計鏡下陽性染色細(xì)胞數(shù)目，結(jié)果如表1所示。與空白相比，D-gal組陽染率增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表1 不同濃度D-gal誘導(dǎo)BMSCs衰老的陽染率

2.6 ALP檢測

各組細(xì)胞上清液中ALP含量見圖7。與Con組相比，D-gal組細(xì)胞上清液的ALP活力顯著下降；與D-gal組相比，IcaH、IcaL、IcaH+D-gal、IcaL+D-gal組細(xì)胞上清液的ALP活力顯著上升，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖7 各組細(xì)胞上清液中ALP活力Fig.7 ALP activity in cell supernatant of each group注：與Con組比較，*P<0.05，**P<0.01；與D-gal組相比，#P<0.05。

2.7 RT-PCR

Ica干預(yù)后，各組BMSCs中P16、P21、P53及Foxo3a、β-catenin的mRNA相對表達(dá)如圖8所示。結(jié)果表明，運(yùn)用D-gal誘導(dǎo)BMSCs衰老后，P16、P53、P21 mRNA表達(dá)顯著增加(P<0.05)；Ica能降低Foxo3a、P53的 mRNA表達(dá)，增加β-catenin 的mRNA的表達(dá)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖8 各組細(xì)胞P16、P21、P53、Foxo3a、β-catenin mRNA表達(dá)情況Fig.8 mRNA expressions of P16, P21, P53, Foxo3a and β-catenin in each group注：與Con組比較，*P<0.05；與D-gal組相比，#P<0.05，##P<0.01。

2.8 Western Blot

Ica干預(yù)衰老BMSCs后，各組細(xì)胞的Foxo3a、β-catenin蛋白表達(dá)如圖9所示，蛋白相對表達(dá)量如圖10所示。與Con組相比，D-gal干預(yù)后可升高D-gal組的Foxo3a蛋白表達(dá)，降低β-catenin 蛋白表達(dá)；Ica處理后能使Foxo3a蛋白表達(dá)減少、β-catenin蛋白表達(dá)增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖9 各組細(xì)胞中Foxo3a、β-catenin蛋白表達(dá)情況Fig.9 Foxo3a and β-catenin protein expression in each group

圖10 各組細(xì)胞中Foxo3a、β-catenin蛋白相對表達(dá)量Fig.10 Relative expression levels of Foxo3a and β-catenin in each group of cells注：與Con組比較，*P<0.05，**P<0.01；與D-gal組相比，#P<0.05，##P<0.01。

3 討論

在骨微環(huán)境中細(xì)胞既是分泌、調(diào)控骨穩(wěn)態(tài)的主要生產(chǎn)者，也是衰老的應(yīng)對者，這使得骨骼隨著年齡的增長愈發(fā)脆弱。相鄰骨細(xì)胞間的功能障礙，導(dǎo)致骨老化表型擴(kuò)散，逐漸引起局部骨組織等功能障礙[5]，這種反饋循環(huán)加重了SOP成骨相關(guān)功能障礙的惡性循環(huán)。猜測通過調(diào)控骨細(xì)胞衰老相關(guān)機(jī)制，通過相關(guān)信號通路、受控的功能網(wǎng)絡(luò)和基本的生化過程等來靶向SOP，實(shí)現(xiàn)延緩或減輕的目的[6]。同時，BMSCs是多能分化干細(xì)胞，在臨床中可與中藥單體聯(lián)合運(yùn)用用于骨缺損部位的定植修復(fù)，但是體外培養(yǎng)擴(kuò)增期間容易出現(xiàn)細(xì)胞衰老的問題，影響后續(xù)臨床應(yīng)用。因此，為模擬出SOP在體外的細(xì)胞環(huán)境、對BMSCs衰老的干預(yù)，本研究通過用D-gal誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的前體細(xì)胞BMSCs衰老，構(gòu)建衰老BMSCs模型。誘導(dǎo)成功的衰老BMSCs會出現(xiàn)形態(tài)扁平、細(xì)胞膜不規(guī)則、折光性差的表現(xiàn)，進(jìn)行SA-β半乳糖苷酶染色有衰老的陽性藍(lán)染細(xì)胞出現(xiàn)，同時衰老BMSCs分泌的ALP減少。

淫羊藿又名棄杖草，是防治SOP的常用中藥之一，在臨床上運(yùn)用效果頗佳。其單體Ica也有多種現(xiàn)代藥理學(xué)作用，現(xiàn)代研究[7-9]表明當(dāng)用Ica處理原代骨細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)它能抑制細(xì)胞的成脂分化，同時通過替代途徑增加成熟成骨細(xì)胞的數(shù)量；抑制破骨細(xì)胞生成，有著雙向抗骨質(zhì)疏松的作用。Ica也具有雌激素樣活性，能增強(qiáng)成骨細(xì)胞的活性，抑制破骨細(xì)胞的增殖和分化[10]。在骨科器械植入手術(shù)中，通過二氧化鈦納米管負(fù)載Ica受控釋放，能減少植入物周圍的纖維化包膜、增加新形成的骨組織厚度可見，改善骨整合過程[11]。Ica的相關(guān)研究及臨床應(yīng)用價值較高。

骨細(xì)胞中Foxos表達(dá)異常與骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松等骨病密切相關(guān)。Foxo3a是Foxo家族的成員，在Foxo3a失活的小鼠中，易受到氧化應(yīng)激影響使成骨細(xì)胞凋亡升高[12]。此外，骨細(xì)胞內(nèi)的Foxo3a能作為保護(hù)分子來影響骨細(xì)胞的成骨分化[13]，減輕骨老化對骨細(xì)胞間功能障礙的影響，對于維持骨穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要[13]。在WNT/β-catenin的經(jīng)典成骨通路中，F(xiàn)oxo 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄能競爭性的結(jié)合共用的β-catenin池，抑制Wnt/β-catenin/TCF 介導(dǎo)的成骨方向的轉(zhuǎn)錄，影響細(xì)胞的成骨[14]。為了探究Ica能否對SOP骨微環(huán)境中的衰老BMSCs有調(diào)節(jié)作用，本研究用Ica干預(yù)誘導(dǎo)的衰老BMSCs，檢測了衰老BMSCs的相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Con組相比，造模后D-gal組衰老BMSCs的Foxo3a mRNA及蛋白表達(dá)顯著增加、β-catenin mRNA及蛋白表達(dá)顯著降低，衰老相關(guān)P16、P53、P21的mRNA表達(dá)顯著升高；細(xì)胞內(nèi)的成骨相關(guān)ALP活力降低，成骨能力下降。而Ica干預(yù)后，能降低Foxo3a、升高β-catenin的mRNA的表達(dá)，降低衰老相關(guān)基因的表達(dá)，提高細(xì)胞內(nèi)的ALP活性。Ica能通過Foxo3a影響Wnt/β-catenin信號通路作用于成骨，但是衰老骨微環(huán)境內(nèi)細(xì)胞間的功能作用以及Ica在SOP研究中多信號通路交互的機(jī)制，仍需要后續(xù)進(jìn)一步的探究。

本研究證實(shí)，D-gal能構(gòu)造衰老BMSCs模型，在體外模擬SOP骨微環(huán)境中的骨細(xì)胞衰老改變。Ica的干預(yù)能較好的改善衰老BMSCs內(nèi)的ALP活力，減少衰老相關(guān)基因的表達(dá)；可能通過激活Foxo3a/β-catenin通路，實(shí)現(xiàn)對衰老BMSCs成骨能力的調(diào)控作用，在對 SOP的防治方面起著積極作用。