蔡葉 王明飛* 張磊 王健 石繼祥 仇建軍 劉鋮祎 周旭

1. 上海中醫(yī)藥大學附屬普陀醫(yī)院，上海 200062 2. 上海市浦東新區(qū)人民醫(yī)院，上海 201200

老年性骨質疏松(senile osteoporosis，SOP)是一種增齡相關的骨科常見病，衰老是該病的潛在危險因素。骨量低下、骨微結構損傷使得SOP患者的骨脆性增加、骨折風險加大[1]。SOP患者在髖部骨折后的死亡率增高，超半數髖部骨折患者的自主生活能力受到影響，嚴重影響著生活質量[2]。SOP的治療在很大程度上依賴于抗吸收藥物，這類藥物不能恢復骨丟失，而是阻止骨吸收，可能出現下頜骨壞死、低鈣血癥等不良反應[3-4]。盡管有許多具有不同藥理特性的抗SOP藥物，但仍有大量患者沒有達到靶向治療效果，且對SOP骨折的緩解效果仍然不佳。因此，尋找有效且安全的藥物仍是重要挑戰(zhàn)。淫羊藿是防治SOP的常用中藥之一，其有效成分淫羊藿苷(icarrin，Ica)有著較好的促進成骨、抑制成脂的調節(jié)作用，應用于絕經后骨質疏松癥模型中的研究較多、效果佳，但是在SOP應用中的影響及機制尚未完全明晰。

骨骼作為調控骨微環(huán)境動態(tài)平衡的器官，雖然受著各類激素的調節(jié)，但嚴密的協(xié)調關系同樣需要骨微環(huán)境中骨細胞的支持。BMSCs(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)作為成骨細胞的前體細胞，在骨微環(huán)境中為了應對損傷，容易參與衰老程序，尤其是在老年時，成骨細胞為了補償破骨細胞骨吸收會存在骨形成不足。所以本研究假設改善衰老BMSCs狀態(tài)、保障成骨分化是治療SOP的一種可能策略，探討Ica對D-半乳糖誘導的衰老BMSCs成骨的影響，并進一步揭示該藥物在SOP中的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

選取SPF級4周齡SD大鼠10只。淫羊藿苷、D-半乳糖(上海融禾，純度>98%)，大鼠BMSCs完全培養(yǎng)基、成骨及成脂誘導分化培養(yǎng)基(Cyagen)，CCK8(同仁)，SA-β-半乳糖苷酶染色盒，ALP試劑盒，RNA提取試劑盒(Vazyme)，反轉錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTM。

1.2 方法

1.2.1BMSCs的分離與培養(yǎng)：通過戊巴比妥鈉麻醉大鼠，將大鼠處死后置于75%乙醇中浸泡15 min。置于超凈臺中分離股骨及脛骨，用滅菌手術剪剪去骨骺端、暴露髓腔。吸培養(yǎng)基沖洗髓腔至骨頭發(fā)白，離心管收集后1 000 r/min離心8 min。重懸細胞，轉移至培養(yǎng)皿，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后首次換液，每2～3 d換液一次。細胞長至80%融合時，胰酶消化后按1∶2傳代，后續(xù)實驗均選用第3代BMSCs。

1.2.2BMSCs的鑒定：按流式試劑盒說明書所示，重懸細胞、檢測BMSCs表面標志物CD44、CD90、CD34、CD45；進行成骨、成脂誘導分化，完成后進行茜素紅染色及油紅O染色，鑒定所提細胞為BMSCs。

1.2.3CCK8測定：將BMSCs接種到96孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)。BMSCs融合狀況較好時，加入用無血清培養(yǎng)基配制的0、2.5、5、10、20、30、40、50、60、70 mg/mL濃度的D-gal、10-3～10-11mol/L濃度的Ica。繼續(xù)培養(yǎng)24 、48 h后，吸棄舊培養(yǎng)基，加入無血清培養(yǎng)基和CCK8，繼續(xù)培養(yǎng)2.5 h。檢測450 nm處的OD值。

1.2.4衰老BMSCs的鑒定：將BMSCs培養(yǎng)至6孔板，選用D-gal誘導BMSCs衰老。SA-β-半乳糖苷酶染色能將衰老BMSCs染成藍色，按說明書所示步驟進行固定、染色等操作。在普通光鏡下觀察，隨機選取3個視野，統(tǒng)計藍色的陽性細胞數量，陽染率(%)=(陽性細胞數/總細胞數)×100%。

1.2.5造模與分組：為了避免細胞自身不同步的復制性衰老，采用D-gal誘導BMSCs進行衰老造模。分成6個組，干預如下：(1)正常(Con)組：無處理；(2)D-半乳糖(D-gal)組：D-gal 30 mg/mL；(3)Ica高劑量(IcaH)組：Ica 10-8mol/L；(4)Ica低劑量(IcaL)組：Ica 10-10mol/L；(5)Ica高劑量+D-gal(IcaH+D-gal)組：Ica 10-8mol/L+D-gal 30 mg/mL；(6)Ica低劑量+D-gal(IcaL+D-gal)組：Ica 10-10mol/L+D-gal 30 mg/mL。

1.2.6檢測指標與方法

1.2.6.1ALP檢測：按說明書配制酚標準液，設空白管、標準管、測定管，混勻，37 ℃水浴15 min，之后加入顯色劑混勻。轉移到96孔板中，檢測520 nm處的 OD值。公式如下：ALP活力(1金氏單位/100 mL體系)=[(OD樣品測定-OD空白)/(OD標準-OD空白)]×C酚標準×100×樣本稀釋倍數。

1.2.6.2Western Blot:PBS清洗6孔板后，加RIPA進行裂解。收集裂解液，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，留蛋白上清液，BCA法測蛋白濃度。加入SDS-PAGE上樣緩沖液，95 ℃干浴鍋中煮8 min。配制膠板，上樣后電泳，90 V讓條帶跑至濃縮膠下緣、再調至120 V跑開。電泳完畢，調300 mA轉膜120 min。封閉，4 ℃一抗孵育過夜。清洗條帶，二抗孵育2 h。顯影，使用Image J分析。

1.2.6.3RT-PCR：取出6孔板，按說明書步驟提各孔RNA，測得濃度。進行反轉錄，收集cDNA。引物序列如下，β-catenin：(F)ACAAGCCACAGGACT ACAAGAAACG；(R)TCAGCAGTCTCATTCCAAGCC ATTG。Foxo3a：(F)ACCTGCGTCACTCAACTCCC；(R)TTGGAGTGTCTGGTTGCCGT。P16：(F)GGT CACCGACAGGCATAACTTC；(R)AAAGGAGGGC TGAGGCCTAA。P21：(F)GGACTCTGAAGATGT GCCTATGGTC；(R)CCTGAGCCTGTTTCGTGTCTAC TG。P53：(F)CCTTACCATCATCACGCTGGAA GAC；(R)AGGACAGGCACAAACACGAACC。按說明書所示配制反應體系，PCR儀中進行反應。結束后分析，2-ΔΔct進行計算。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 細胞的形態(tài)學觀察

圖1所示依次為原代BMSCs和第2代的BMSCs。當細胞尚未傳代時，可見較多混雜細胞。隨著傳代過程逐漸純化，BMSCs表現為長梭形、多角形等形態(tài)，常呈現出漩渦狀或放射狀的聚集形態(tài)，混雜細胞明顯減少。

圖1 不同時間點的BMSCs鏡下圖(100×)Fig.1 BMSCs mirror at different time points (100×)

2.2 BMSCs的鑒定

對BMSCs的特異性表面特異性標志物進行流式鑒定，結果如圖2所示。CD44和CD90表達分別為99.78%和99.77%，>95%；CD34、CD45表達分別為0.66%、0.57%，< 5%，指標符合BMSCs表面標志物特征。

圖2 BMSCs表面不同特異性標志物的流式細胞術鑒定結果Fig.2 Flow cytometry identification results of different specific markers on BMSCs surface

2.3 BMSCs的茜素紅染色、油紅O染色

對BMSCs進行成骨、成脂誘導分化及其染色，結果如圖3所示。成骨誘導結束后，進行茜素紅染色，可見被染成橘紅色的鈣結節(jié)(圖3A)；成脂誘導結束后，用油紅O液染色，可見被染色成橘色的球形透明脂滴(圖3B)。結合流式細胞術和成骨、成脂誘導分化染色，可驗證所提細胞為BMSCs。

圖3 BMSCs成骨、成脂誘導后對應的茜素紅染色(A)、油紅O染色(B)Fig.3 Alizarin red staining (A) and oil red O staining (B) were performed on BMSCs after osteogenesis and lipid induction

2.4 CCK8測定

設置不同濃度梯度的D-gal及Ica處理BMSCs，分別處理24、48 h，檢測細胞增殖。如圖4、圖5所示。CCK8結果提示D-gal誘導細胞衰老的最適處理濃度為30 mg/mL，該濃度不影響B(tài)MSCs增殖且為D-gal不同濃度范圍內的較高濃度；Ica干預濃度選用最適濃度范內的10-8、10-10mol/L為處理的高、低濃度，使用這些濃度對后續(xù)實驗中的BMSCs進行干預48 h。

圖4 D-gal處理BMSCs不同時間的細胞增殖Fig.4 Cell proliferation of BMSCs treated with D-Gal at different times注：與Con組比較，處理24 h組別中，*P<0.05；處理48 h組別中，#P<0.05。

圖5 Ica處理BMSCs不同時間的細胞增殖Fig.5 Cell proliferation of BMSCs treated by Ica at different times注：與Con組比較，處理24 h組別中，*P<0.05，**P<0.01；處理48 h組別中，#P<0.05。

2.5 衰老BMSCs檢測

衰老BMSCs的形態(tài)變化(200×)如圖6所示，衰老BMSCs的細胞形態(tài)扁平、體積稍增大；細胞膜形狀不規(guī)整，折光度較差；細胞質內空泡稍增多。進行SA-β-半乳糖苷酶染色后，鏡下(100×)可見藍色的衰老BMSCs。

圖6 衰老BMSCs的細胞形態(tài)Fig.6 Cell morphology of senescent BMSCs

對6孔板中BMSCs進行SA-β-半乳糖苷酶染色后，統(tǒng)計鏡下陽性染色細胞數目，結果如表1所示。與空白相比，D-gal組陽染率增高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

表1 不同濃度D-gal誘導BMSCs衰老的陽染率

2.6 ALP檢測

各組細胞上清液中ALP含量見圖7。與Con組相比，D-gal組細胞上清液的ALP活力顯著下降；與D-gal組相比，IcaH、IcaL、IcaH+D-gal、IcaL+D-gal組細胞上清液的ALP活力顯著上升，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖7 各組細胞上清液中ALP活力Fig.7 ALP activity in cell supernatant of each group注：與Con組比較，*P<0.05，**P<0.01；與D-gal組相比，#P<0.05。

2.7 RT-PCR

Ica干預后，各組BMSCs中P16、P21、P53及Foxo3a、β-catenin的mRNA相對表達如圖8所示。結果表明，運用D-gal誘導BMSCs衰老后，P16、P53、P21 mRNA表達顯著增加(P<0.05)；Ica能降低Foxo3a、P53的 mRNA表達，增加β-catenin 的mRNA的表達，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖8 各組細胞P16、P21、P53、Foxo3a、β-catenin mRNA表達情況Fig.8 mRNA expressions of P16, P21, P53, Foxo3a and β-catenin in each group注：與Con組比較，*P<0.05；與D-gal組相比，#P<0.05，##P<0.01。

2.8 Western Blot

Ica干預衰老BMSCs后，各組細胞的Foxo3a、β-catenin蛋白表達如圖9所示，蛋白相對表達量如圖10所示。與Con組相比，D-gal干預后可升高D-gal組的Foxo3a蛋白表達，降低β-catenin 蛋白表達；Ica處理后能使Foxo3a蛋白表達減少、β-catenin蛋白表達增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖9 各組細胞中Foxo3a、β-catenin蛋白表達情況Fig.9 Foxo3a and β-catenin protein expression in each group

圖10 各組細胞中Foxo3a、β-catenin蛋白相對表達量Fig.10 Relative expression levels of Foxo3a and β-catenin in each group of cells注：與Con組比較，*P<0.05，**P<0.01；與D-gal組相比，#P<0.05，##P<0.01。

3 討論

在骨微環(huán)境中細胞既是分泌、調控骨穩(wěn)態(tài)的主要生產者，也是衰老的應對者，這使得骨骼隨著年齡的增長愈發(fā)脆弱。相鄰骨細胞間的功能障礙，導致骨老化表型擴散，逐漸引起局部骨組織等功能障礙[5]，這種反饋循環(huán)加重了SOP成骨相關功能障礙的惡性循環(huán)。猜測通過調控骨細胞衰老相關機制，通過相關信號通路、受控的功能網絡和基本的生化過程等來靶向SOP，實現延緩或減輕的目的[6]。同時，BMSCs是多能分化干細胞，在臨床中可與中藥單體聯(lián)合運用用于骨缺損部位的定植修復，但是體外培養(yǎng)擴增期間容易出現細胞衰老的問題，影響后續(xù)臨床應用。因此，為模擬出SOP在體外的細胞環(huán)境、對BMSCs衰老的干預，本研究通過用D-gal誘導成骨細胞的前體細胞BMSCs衰老，構建衰老BMSCs模型。誘導成功的衰老BMSCs會出現形態(tài)扁平、細胞膜不規(guī)則、折光性差的表現，進行SA-β半乳糖苷酶染色有衰老的陽性藍染細胞出現，同時衰老BMSCs分泌的ALP減少。

淫羊藿又名棄杖草，是防治SOP的常用中藥之一，在臨床上運用效果頗佳。其單體Ica也有多種現代藥理學作用，現代研究[7-9]表明當用Ica處理原代骨細胞后，發(fā)現它能抑制細胞的成脂分化，同時通過替代途徑增加成熟成骨細胞的數量；抑制破骨細胞生成，有著雙向抗骨質疏松的作用。Ica也具有雌激素樣活性，能增強成骨細胞的活性，抑制破骨細胞的增殖和分化[10]。在骨科器械植入手術中，通過二氧化鈦納米管負載Ica受控釋放，能減少植入物周圍的纖維化包膜、增加新形成的骨組織厚度可見，改善骨整合過程[11]。Ica的相關研究及臨床應用價值較高。

骨細胞中Foxos表達異常與骨關節(jié)炎、骨質疏松等骨病密切相關。Foxo3a是Foxo家族的成員，在Foxo3a失活的小鼠中，易受到氧化應激影響使成骨細胞凋亡升高[12]。此外，骨細胞內的Foxo3a能作為保護分子來影響骨細胞的成骨分化[13]，減輕骨老化對骨細胞間功能障礙的影響，對于維持骨穩(wěn)態(tài)至關重要[13]。在WNT/β-catenin的經典成骨通路中，Foxo 介導的轉錄能競爭性的結合共用的β-catenin池，抑制Wnt/β-catenin/TCF 介導的成骨方向的轉錄，影響細胞的成骨[14]。為了探究Ica能否對SOP骨微環(huán)境中的衰老BMSCs有調節(jié)作用，本研究用Ica干預誘導的衰老BMSCs，檢測了衰老BMSCs的相關指標。結果發(fā)現，與Con組相比，造模后D-gal組衰老BMSCs的Foxo3a mRNA及蛋白表達顯著增加、β-catenin mRNA及蛋白表達顯著降低，衰老相關P16、P53、P21的mRNA表達顯著升高；細胞內的成骨相關ALP活力降低，成骨能力下降。而Ica干預后，能降低Foxo3a、升高β-catenin的mRNA的表達，降低衰老相關基因的表達，提高細胞內的ALP活性。Ica能通過Foxo3a影響Wnt/β-catenin信號通路作用于成骨，但是衰老骨微環(huán)境內細胞間的功能作用以及Ica在SOP研究中多信號通路交互的機制，仍需要后續(xù)進一步的探究。

本研究證實，D-gal能構造衰老BMSCs模型，在體外模擬SOP骨微環(huán)境中的骨細胞衰老改變。Ica的干預能較好的改善衰老BMSCs內的ALP活力，減少衰老相關基因的表達；可能通過激活Foxo3a/β-catenin通路，實現對衰老BMSCs成骨能力的調控作用，在對 SOP的防治方面起著積極作用。