劉 帥，蔣 麗

(1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心，上海 201306；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水生動物基因組學(xué)重點實驗室，北京 100141)

日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)俗稱青蝦、河蝦，屬于節(jié)肢動物門(Arthropoda)甲殼綱(Crustacea)十足目(Decapoda)長臂蝦科(Palaemonidae)沼蝦屬(Macrobrachium)，廣泛分布于我國及東南亞大部分地區(qū)，由于其肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)豐富，是我國重要的淡水養(yǎng)殖蝦種之一。雌雄差異及群體均勻度低是制約集約化養(yǎng)殖產(chǎn)量的主要因素，因而，從基因組水平對其體重相關(guān)的基因進(jìn)行解析，進(jìn)而培育具有較高均勻度且增重快的新品種對其養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展具有戰(zhàn)略意義。

全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association study,GWAS)是現(xiàn)代分子育種的重要輔助手段，通過單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)與目標(biāo)性狀之間的關(guān)聯(lián)檢驗，實現(xiàn)相關(guān)基因的定位，在水產(chǎn)動物育種中發(fā)揮著重要作用。經(jīng)典的GWAS只針對單一性狀進(jìn)行分析，但當(dāng)不同性狀間存在遺傳相關(guān)時，考慮性狀間協(xié)方差的多性狀分析相較于單性狀分析具有更高的檢驗功效[1]和參數(shù)估計的精度[2]。已有研究證明，多性狀聯(lián)合 GWAS分析對顯著遺傳變異的檢測能力更強(qiáng)[3]，且更具生物學(xué)意義[4]?；诖?，筆者對日本沼蝦體重和出肉率性狀進(jìn)行聯(lián)合分析，實現(xiàn)對相關(guān)基因的定位和篩選，以期為日本沼蝦生長增重的基因表達(dá)解析提供理論支撐，進(jìn)而促進(jìn)其養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗群體及表型測量試驗用蝦養(yǎng)殖于中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心宜興大浦基地，收集日齡52 d的成熟蝦，隨機(jī)挑選200尾健康蝦(雌雄各100尾)編號，記錄體重，收集蝦尾部的肌肉并稱重，尾部肌肉與體重的比值為出肉率。此外，收集的肌肉需轉(zhuǎn)入凍存管中于-80 ℃保存，以便進(jìn)行DNA提取。

1.2 DNA提取、測序及基因型數(shù)據(jù)的獲取以收集的肌肉組織為材料，根據(jù)酚-氯仿法[5]提取DNA，使用1%瓊脂糖凝膠評估提取DNA質(zhì)量，并將其濃度調(diào)整至2.5 μg/μL，最終在北京華大基因完成序列測定。原始測序數(shù)據(jù)經(jīng)工具包NGS QC Toolkit[6]質(zhì)控過濾后，通過軟件BWA[7]與日本沼蝦參考基因組(GCA_015104395.1)進(jìn)行對比分析，通過軟件Picard(https://github.com/broadinstitute/picard)去除對比結(jié)果中的重復(fù)序列，最終由軟件GATK(https://github.com/broadinstitute/gatk)實現(xiàn)SNP位點的篩選，從而完成基因分型。獲得的分型數(shù)據(jù)需要通過PLINK[8]軟件進(jìn)一步質(zhì)控和過濾，去除樣本分型成功率≤90%，最小等位基因頻率≤5%的位點并生成二進(jìn)制基因型數(shù)據(jù)。

1.3 全基因組關(guān)聯(lián)分析分別對體重、出肉率性狀進(jìn)行單性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析，并對2個性狀進(jìn)行多性狀聯(lián)合分析，其中單性狀分析使用GEMMA[9]軟件中的單性狀混合模型分析，多性狀聯(lián)合分析采用GEMMA軟件中的多性狀線性混合模型。以Bonferroni校正閾值[10]為界限篩選與性狀顯著相關(guān)的SNP位點，并通過R語言繪制曼哈頓和Q-Q圖。

1.4 基因注釋根據(jù)檢驗顯著SNP位點于參考基因組上的物理位置，提取其上下游區(qū)域250 kb范圍內(nèi)的序列，通過軟件KOBAS(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/kobas3)調(diào)整參數(shù)“-e 1e-5”實現(xiàn)對提取序列的注釋，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)檢索實現(xiàn)注釋的功能注釋。

2 結(jié)果與分析

2.1 表型及基因型描述統(tǒng)計剔除體重、出肉率表型數(shù)據(jù)中的缺失項后共獲得181尾蝦的表型數(shù)據(jù)(表1)，性狀間的相關(guān)關(guān)系及分布見圖1～3?；?81尾蝦分型獲得的基因型數(shù)據(jù)中剔除分型成功率≤90%及最小等位基因頻率≤5%的位點后，共獲得7 793個高質(zhì)量SNP位點。

表1 表型描述性統(tǒng)計Table 1 Descriptive statistics of phenotype

圖1 日本沼蝦體重性狀分布Fig.1 Distribution in traits of body weight for Macrobrachium nipponense

2.2 全基因組關(guān)聯(lián)分析對體重、出肉率進(jìn)行單一性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析及兩性狀的聯(lián)合分析，結(jié)果如圖4所示。觀察圖4 d～圖4f，根據(jù)統(tǒng)計檢驗概率P值擬合的實際曲線均與理論曲線有較高的一致性，且基因組控制值(λ)位于1.00附近[11]，說明關(guān)聯(lián)檢驗的統(tǒng)計準(zhǔn)確性較高，進(jìn)而可說明曼哈頓圖中檢測到的SNP具有較高的可信度(圖4a～c)，水平線表示Bonferroni校正閾值(0.05/7793，6.42e-06)分布于水平線上方的位點具有與性狀的顯著相關(guān)性。由圖4a可知，在體重單性狀關(guān)聯(lián)分析中，僅檢測到1個SNP位點與之相關(guān)；在出肉率的單性狀關(guān)聯(lián)分析中(圖4b)，并未檢查測到顯著SNP位點；在兩性狀的聯(lián)合分析中(圖4c)，共檢測到6個SNP位點，且體重單性狀分析檢測到的SNP位點也被包含在內(nèi)，這證明多性狀聯(lián)合分析對SNP檢測的效率具有顯著提升作用。

圖2 日本沼蝦出肉率性狀分布Fig.2 Distribution in traits of meat rate for Macrobrachium nipponense

圖3 日本沼蝦體重和出肉率性狀相關(guān)關(guān)系Fig.3 The correlation between trait of body weight and meat rate in Macrobrachium nipponense

圖4 日本沼蝦體重、出肉率單一分析及聯(lián)合分析的曼哈頓和Q-Q圖Fig.4 The manhattan and Q-Q plot of single and combine analysis for body weight,meat rate in Macrobrachium nipponense

2.3 候選基因根據(jù)日本沼蝦體重和出肉率聯(lián)合分析獲得的顯著SNP 位點為探針，提取其所在日本沼蝦全基因組位置上下游250 bp區(qū)域內(nèi)的序列，通過數(shù)據(jù)庫kobas完成候選基因的在線注釋與鑒定，共鑒定出5個候選基因(表 2)，分別為Jrkl(JRK like)、Tep2(Thioester-containing protein 2)、ZNF84(zinc finger protein 84)、CG12299和swm(second mitotic wave missing)。通過KEGG通路注釋分析，這些候選基因主要參與基因表達(dá)調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白酶解、內(nèi)肽酶分析及先天性免疫系統(tǒng)發(fā)育等生物學(xué)過程，在機(jī)體分化發(fā)育方面發(fā)揮著重要作用。

表2 日本沼蝦體重和出肉率兩性狀聯(lián)合分析的顯著位點與基因Table 2 Significant loci and genes of joint analysis for body weight and meat yield in Macrobrachium nipponense

3 討論

隨著測序成本的下降及多種水產(chǎn)動物基因組全測序的完成，GWAS技術(shù)逐漸應(yīng)用于水產(chǎn)動物的基因定位及育種領(lǐng)域。吳碧銀等[12]通過GWAS分析技術(shù)發(fā)現(xiàn)了影響低氧環(huán)境下鯉耐受性的23個候選基因。陳小明等[13]利用GWAS檢測到26個與大黃魚耐高溫相關(guān)的基因。徐鴻飛等[14]對紅羅非魚低溫體色變異現(xiàn)象進(jìn)行GWAS分析，發(fā)現(xiàn)了19個與之相關(guān)的功能基因。

盡管GWAS在水產(chǎn)動物已有諸多應(yīng)用，但大多數(shù)都是針對單一表型的關(guān)聯(lián)分析，而水產(chǎn)動物的表型如體重、體長、性別之間存在顯著相關(guān)性，因而對表型進(jìn)行單一性狀關(guān)聯(lián)分析時，通常會忽略某個SNP位點對多個性狀的共同影響，致使檢驗SNP位點的個數(shù)變少，篩選到的候選基因精度降低。相較于單一性狀關(guān)聯(lián)分析，多個性狀聯(lián)合分析方法在顯著SNP的定位上表現(xiàn)出更高的檢測能力和精確度。通過對比日本沼蝦體重和出肉率兩性狀 GWAS 與兩性狀分別進(jìn)行單一性狀 GWAS 的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在相同的顯著水準(zhǔn)下，前者檢測到 6個顯著SNP 遠(yuǎn)多于后兩者共檢測到的1個與體重相關(guān)的SNP?；诼?lián)合分析檢測到的6個顯著SNP位點篩選到的5個功能基因中，Jrkl為功能未知的新基因；Tep2編碼含硫蛋白2，參與代謝、細(xì)胞程序性死亡及免疫應(yīng)激等有關(guān)生物學(xué)活動的調(diào)控[15]；ZNF84和CG12299[16]分別編碼鋅指蛋白84和鋅指蛋白135，作為鋅指蛋白家族的成員，可通過其鋅指結(jié)構(gòu)域與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合進(jìn)而調(diào)控基因表達(dá)[17]，參與細(xì)胞增殖、分化和凋亡等多種生理過程，維持組織穩(wěn)態(tài)；swm編碼的蛋白是Hh信號的負(fù)調(diào)節(jié)因子[18]，對細(xì)胞極性至關(guān)重要。該研究定位到的候選基因都與機(jī)體發(fā)育相關(guān)，可能在日本沼蝦體重和出肉率性狀的表現(xiàn)上有重要影響，因而可對日本沼蝦體重和出肉率的解析提供理論支撐。