謝永平，賀會(huì)利，龐彬輝

(1.廣西獸醫(yī)研究所，廣西南寧530001；2.廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530001)

食蟹猴與人類的遺傳同源性高達(dá)95%，同時(shí)具有繁殖周期短、體型小、性格溫順等優(yōu)點(diǎn)，常用于遺傳學(xué)、生理學(xué)、免疫學(xué)等方面的研究[1]，是國(guó)內(nèi)外重要的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究模型[2]。從目前監(jiān)測(cè)結(jié)果來看，寄生蟲和細(xì)菌引起的食蟹猴疾病問題尤為突出[3-5]。寄生蟲檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸小袋纖毛蟲的感染率高達(dá)24.29%，結(jié)腸小袋纖毛蟲(Balantidiumcoli)屬于纖毛蟲門動(dòng)基裂綱毛口目小袋蟲科小袋蟲屬，發(fā)育過程中有滋養(yǎng)體和包囊2種形態(tài)[6]。結(jié)腸小袋纖毛蟲是寄生在動(dòng)物腸道的原生動(dòng)物寄生蟲，會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物機(jī)體腹瀉、結(jié)腸充血、出血、潰瘍和穿孔等。結(jié)腸小袋纖毛蟲病是一種水源性、呈世界性分布的人畜共患原蟲病。大腸桿菌(Escherichiacoli)是臨床上主要引起動(dòng)物腹瀉的常見細(xì)菌。大腸桿菌是一種革蘭氏陰性短桿菌，周生鞭毛，能運(yùn)動(dòng)，無芽孢。大腸桿菌是動(dòng)物體內(nèi)一種重要的腸道菌群，大多不致病，屬于條件性致病菌。其中，某些血清型菌株的致病性強(qiáng)，會(huì)引起腹瀉，統(tǒng)稱致病性大腸桿菌。致病性大腸桿菌是一種重要的人獸共患病原菌，其血清型復(fù)雜，可引起動(dòng)物腹瀉、肺炎、泌尿道感染和敗血癥等[7]。肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)是一種革蘭氏陰性條件性致病菌，是腸桿菌科克雷伯氏菌屬中最為重要的一類菌(俗稱肺炎桿菌)，肺炎克雷伯氏菌所致疾病占克雷伯氏菌屬感染的95%以上。肺炎克雷伯氏菌在自然界廣泛存在，容易產(chǎn)生耐藥性，大多存在于人體上呼吸道和腸道，當(dāng)機(jī)體抵抗力降低時(shí)，經(jīng)呼吸道進(jìn)入肺部，從而引起大葉或小葉融合性實(shí)變，以上葉較為多見，此外也可導(dǎo)致腦膜炎、泌尿系統(tǒng)發(fā)炎、傷口感染甚至敗血癥等[8]。筆者對(duì)20只腹瀉食蟹猴進(jìn)行臨床檢查、寄生蟲學(xué)、分子生物學(xué)和細(xì)菌學(xué)檢查，旨在為食蟹猴腹瀉時(shí)的臨床用藥提供科學(xué)依據(jù)，為預(yù)防和治療食蟹猴腹瀉提供參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1病料樣品采集。2021年采集廣西某食蟹猴飼養(yǎng)場(chǎng)患有腹瀉癥狀的成年食蟹猴新鮮糞便樣品20份，裝于干凈的自封塑料袋中，送至實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。陽(yáng)性樣品由廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2試驗(yàn)動(dòng)物。食蟹猴1.5～2.5歲，體重2 kg左右，伴有下痢，排出黃色水樣糞便；有時(shí)糞便混有血液、惡臭，食蟹猴精神及食欲明顯減退，2 d后其他食蟹猴也相繼出現(xiàn)下痢癥狀。4～5周齡雄性昆明小鼠12只，體重18～20 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.3主要器材與試劑。恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司；小型臺(tái)式高速離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；帶測(cè)微尺的顯微鏡購(gòu)自尼康映像儀器銷售(中國(guó))有限公司；離心管、燒杯、接種環(huán)、載玻片、蓋玻片、60～100目銅篩，均購(gòu)自南寧生化藥品儀器有限公司；糞便基因組DNA提取試劑盒、2× ESTaqMasterMix、DL 2000 DNA Marker，均購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。BIOWEST凝膠瓊脂購(gòu)自GENE公司；PCR儀購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自Bio-Rad公司。伊紅美蘭培養(yǎng)基購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；血瓊脂平板培養(yǎng)基購(gòu)自鄭州安圖生物工程股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1寄生蟲檢測(cè)。采用直接涂片法，首先在載玻片上滴加1滴滅菌的生理鹽水，然后用竹簽挑取少許被檢猴新鮮糞便在生理鹽水中涂抹均勻，最后加蓋玻片后置于光學(xué)顯微鏡下觀察。此方法可檢查糞便中大多數(shù)蟲卵。

1.2.2PCR檢測(cè)。按照試劑盒說明書提取糞便樣品中的DNA，將提取的DNA置于-20 ℃下保存。以提取DNA為模板，參考文獻(xiàn)[9]的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5% 瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，利用凝膠成像系統(tǒng)觀察并分析電泳結(jié)果。

1.2.3細(xì)菌學(xué)檢查。

1.2.3.1細(xì)菌分離培養(yǎng)與16S rRNA測(cè)序鑒定。無菌條件下采集糞便樣品，分別劃線接種于血瓊脂平板培養(yǎng)基和伊紅美蘭培養(yǎng)基上，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h后觀察。挑取4個(gè)特征典型的單個(gè)菌落純化后進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢，對(duì)細(xì)菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。將純化的菌株通過PCR擴(kuò)增16S rRNA 序列后，送至蘇州金唯智生物科技有限公司測(cè)序。

1.2.3.2藥敏試驗(yàn)。采用NCCLS[9]推薦的K-B紙片法，在無菌條件下取100 μL純化后培養(yǎng)的菌液均勻涂于血瓊脂平板培養(yǎng)基上，選取青霉素類、頭孢菌素類、氟喹諾酮類、氨基糖苷類等18種常用抗菌藥物貼在血瓊脂平板培養(yǎng)基上，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h后，使用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑(Ф)，判定其耐藥性。

1.2.3.3小鼠致病性試驗(yàn)。選取健康昆明小鼠12只，隨機(jī)分成試驗(yàn)組和對(duì)照組2組，每組6只。將分離菌混合培養(yǎng)后按0.2 mL/只(濃度為109CFU/mL)接種于試驗(yàn)組小鼠腹腔內(nèi)，對(duì)照組注射等量的生理鹽水，觀察并記錄小鼠的臨床癥狀及發(fā)病、致死情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 寄生蟲檢測(cè)經(jīng)鏡檢發(fā)現(xiàn)，10份糞便中有大量巨大橢圓形或梨形的結(jié)腸小袋纖毛蟲滋養(yǎng)體(圖1)，呈無色透明或略帶綠色淡灰，大小為(30～150)μm×(25～120)μm，蟲體前端略尖，腹面有一胞口，后端略鈍，有一胞肛，體表有斜縱排列的纖毛，可迅速旋轉(zhuǎn)前進(jìn)。結(jié)腸小袋纖毛蟲包囊呈近圓形，直徑為40～60 μm，呈淡黃或淡綠色，外被2層囊膜，囊壁較厚(圖2)。鏡檢未發(fā)現(xiàn)阿米巴原蟲、鞭蟲、類圓線蟲等寄生蟲。

圖1 結(jié)腸小袋纖毛蟲滋養(yǎng)體(400×)Fig.1 The trophozoite of B.coli(400×)

圖2 結(jié)腸小袋纖毛蟲包囊(400 ×)Fig.2 The cystica of B.coli(400×)

2.2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖3所示。20份腹瀉食蟹猴糞便中有10份陽(yáng)性樣品。

2.3 形態(tài)學(xué)特征鑒定和16S rRNA測(cè)序細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，20份糞便在伊紅美蘭培養(yǎng)基上發(fā)現(xiàn)紫黑色帶金屬光澤的細(xì)菌，初步判斷為大腸桿菌。經(jīng)16S rRNA 測(cè)序后進(jìn)行序列比對(duì)，伊紅美蘭培養(yǎng)基上的菌落與NCBI網(wǎng)站登錄的大腸桿菌(登錄號(hào)MN208144.1)同源性為99.79%，證實(shí)為大腸桿菌(圖4)。12份糞便樣品在血瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)出4個(gè)典型菌落，菌落經(jīng)純化后進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢，其中1個(gè)菌落呈灰白色、中間隆起、膿狀，邊緣呈鋸齒狀，周圍無溶血，經(jīng)革蘭氏染色后鏡檢可見革蘭氏陰性、細(xì)小的點(diǎn)狀菌。經(jīng)16S rRNA測(cè)序后進(jìn)行序列比對(duì)，與NCBI網(wǎng)站登錄的肺炎克雷伯氏菌(登錄號(hào)CP052372.1)同源性為99.81%，證實(shí)為肺炎克雷伯氏菌(圖5)。另外1個(gè)菌落為革蘭氏陰性桿狀菌，經(jīng)測(cè)序與伊紅美蘭培養(yǎng)基上的菌落為同一菌落(大腸桿菌)。其余2個(gè)菌落經(jīng)16S rRNA測(cè)序后鑒定為環(huán)境菌。

圖4 大腸桿菌Fig.4 Escherichia coli

圖5 肺炎克雷伯氏菌Fig.5 Klebsiella pneumoniae

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果將分離的大腸桿菌和肺炎克雷伯氏菌混合后進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分離的大腸桿菌和肺炎克雷伯氏菌對(duì)阿米卡星、頭孢他啶、頭孢西丁、頭孢噻呋鈉高度敏感，對(duì)壯觀霉素、卡那霉素、阿莫西林、恩諾沙星、氧氟沙星中度敏感，而對(duì)青霉素、鏈霉素、慶大霉素等耐藥(表1)。

表1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 1 The drug sensitivity test results of the isolated bacteria

2.5 小鼠致病性試驗(yàn)試驗(yàn)組小鼠在接種混合菌8 h后精神狀態(tài)變差、活動(dòng)量減少，24 h后陸續(xù)死亡，最終3只小鼠死亡，表明該菌有較強(qiáng)的致病性。通過解剖死亡小鼠發(fā)現(xiàn)小鼠肺部、肝部出現(xiàn)腫大，有出血點(diǎn)，胃黏膜出血，腸黏膜充血、變薄。通過對(duì)腸道內(nèi)容物的鑒定確定為大腸桿菌和肺炎克雷伯氏菌混合感染。對(duì)照組小鼠精神狀態(tài)良好，無死亡，剖檢未見明顯病理變化。

注：M.DNA Marker DL 2000；1.陽(yáng)性對(duì)照；2～12.部分病料樣品；13.陰性對(duì)照。Note：M.DNA Marker DL 2000；1.Positive control；2-12.Partial samples of epidemic materials；13.Negative control.圖3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠檢測(cè)結(jié)果Fig.3 The agarose gel electrophoresis results of PCR amplification products

3 討論

腹瀉是臨床上常見癥狀之一，主要是由于飼養(yǎng)不當(dāng)，細(xì)菌、病毒、寄生蟲感染所致。筆者通過對(duì)20份腹瀉食蟹猴糞便進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，10份糞便樣本中檢測(cè)到結(jié)腸小袋纖毛蟲滋養(yǎng)體，20份糞便樣本中檢測(cè)到大腸桿菌，12份糞便樣本中檢測(cè)出肺炎克雷伯氏菌。總體來看，10份糞便樣本為三重感染，2份糞便樣本為大腸桿菌和肺炎克雷伯氏菌混合感染，其余8份糞便樣本為大腸桿菌感染。結(jié)腸小袋纖毛蟲滋養(yǎng)體較大且具有運(yùn)動(dòng)性，通過寄生蟲鏡檢很容易發(fā)現(xiàn)，同時(shí)經(jīng)PCR方法檢測(cè)確定為結(jié)腸小袋纖毛蟲。結(jié)腸小袋纖毛蟲感染機(jī)體后可借助纖毛侵害多種臟器，主要侵害結(jié)腸、盲腸、直腸等，造成腸道黏膜的破壞和脫落[10]。通過替硝唑、伊維菌素、甲硝唑治療發(fā)現(xiàn)甲硝唑的治療效果較好，這與前期試驗(yàn)結(jié)果[3]相一致。在治療過程中應(yīng)避免反復(fù)發(fā)作，應(yīng)多次使用驅(qū)蟲藥，以達(dá)到徹底控制和消滅該寄生蟲的目的。由于該寄生蟲可導(dǎo)致人感染，在治療和預(yù)防猴群發(fā)生結(jié)腸小袋纖毛蟲時(shí)，應(yīng)注意飼養(yǎng)人員、獸醫(yī)工作者以及相關(guān)工作人員的個(gè)人衛(wèi)生，做好消毒工作，定期對(duì)猴場(chǎng)工作人員進(jìn)行體檢，防止寄生蟲感染。

臨床上常見的引起動(dòng)物腹瀉的細(xì)菌有大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌等[11]。大腸桿菌和肺炎克雷伯氏菌均屬于腸道桿菌，其生物學(xué)特性有許多相似之處，不容易區(qū)分，給診斷帶來了一定困難[12]。該試驗(yàn)使用2種培養(yǎng)基，最后進(jìn)行16S rRNA 基因測(cè)序，發(fā)現(xiàn)2種致病菌。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，這2 種細(xì)菌對(duì)阿米卡星、頭孢他啶、頭孢西丁、頭孢噻呋鈉高度敏感，而對(duì)青霉素、鏈霉素、慶大霉素等9種藥物耐藥。為了避免耐藥性的產(chǎn)生，應(yīng)當(dāng)科學(xué)合理選擇藥物，交替使用不同的抗生素或者聯(lián)合用藥。通過小鼠致病性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，這2種細(xì)菌均可以引起小鼠感染并死亡，說明混合感染會(huì)加重病情甚至造成死亡率上升。致病性大腸桿菌引起的動(dòng)物腹瀉在臨床上十分常見，是引起人類和動(dòng)物疾病的重要病原菌，豬、雞、牛、羊等動(dòng)物均容易感染，不同動(dòng)物感染后臨床癥狀也不相同[13-17]。機(jī)體感染致病性大腸桿菌后，輕者腹瀉，重者出現(xiàn)各臟器炎癥、敗血癥等，嚴(yán)重時(shí)可致死。在該病的防治方面，要加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，及時(shí)發(fā)現(xiàn)，徹底治療，減少傳播風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)場(chǎng)地、用具、車輛等徹底消毒，從根本上杜絕該病的大范圍流行。近年來，肺炎克雷伯氏菌已經(jīng)成為僅次于大腸桿菌的第二大條件性致病菌，是一種人畜共患傳染病[18]，廣泛存在于呼吸道和消化道，可引起肺炎、腦膜炎、泌尿感染、敗血癥等，畜禽、野生動(dòng)物、水生動(dòng)物等均容易感染[19-21]。不合理用藥也會(huì)導(dǎo)致該毒株的耐藥性不斷增強(qiáng)，對(duì)人類的健康造成很大的威脅。此次調(diào)查是首次在腹瀉食蟹猴中分離到肺炎克雷伯氏菌，通過對(duì)此次病例分析，可為該病臨床診斷提供參考依據(jù)。

目前全世界科研工作者對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性要求越來越高，對(duì)試驗(yàn)食蟹猴的品質(zhì)要求也越來越嚴(yán)格。廣西因其優(yōu)越的地理位置及適宜的環(huán)境，成為全國(guó)人工養(yǎng)殖量最大的食蟹猴養(yǎng)殖基地，因此加強(qiáng)食蟹猴疾病的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)對(duì)于提升其品質(zhì)具有十分重要的意義。此次調(diào)查中檢測(cè)到的結(jié)腸小袋纖毛蟲、大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌均可導(dǎo)致人畜共患病，會(huì)對(duì)公共衛(wèi)生造成威脅，一旦發(fā)現(xiàn)患此病應(yīng)立刻采取有效措施，選擇安全、高效的抗寄生蟲藥物和抗生素治療，減少疫病傳播，避免造成不必要的經(jīng)濟(jì)損失。