張家勝 王劍 郁婷婷
上海交通大學醫(yī)學院附屬上海兒童醫(yī)學中心遺傳分子診斷科,上海 200127
骨骼是人體運動系統(tǒng)最重要的組成部分。在人體整個生命周期中,骨骼通過嚴格調(diào)控舊骨吸收和新骨生成的平衡來維持骨重塑穩(wěn)態(tài)。破骨細胞負責骨吸收,是控制骨重塑的關(guān)鍵細胞,對維持骨穩(wěn)態(tài)平衡至關(guān)重要[1-2]。研究發(fā)現(xiàn),胚胎第7天左右,紅細胞髓系祖細胞出現(xiàn)在卵黃囊造血島,并分化為集落刺激因子1受體(colony stimulating factor 1 receptor, CSF1R)陽性卵黃囊巨噬細胞,可作為破骨細胞的前體[3]。出生后,這些前體細胞逐漸被造血干細胞來源的單核細胞前體所取代,并相互融合,部分也與長期存活的紅細胞髓系祖細胞來源的破骨細胞合胞體反復融合,形成多核破骨細胞[4]。破骨細胞分化成熟是發(fā)揮骨吸收功能的前提,其分化過程受多種因子調(diào)控。
研究顯示,活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)是破骨細胞分化成熟過程中關(guān)鍵的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導分子[5],對破骨細胞分化具有重要的調(diào)控作用,針對ROS清除的抗氧化劑可抑制破骨細胞分化成熟[6-9]。本文就ROS調(diào)控破骨細胞分化成熟的研究進展進行綜述,以期為溶骨亢進型疾病如骨質(zhì)疏松癥等提供更廣泛的治療思路。
ROS是氧氣轉(zhuǎn)化為水的過程中氧化還原反應(yīng)的中間產(chǎn)物,包括氧自由基和非自由基氧化劑。氧自由基包括超氧陰離子(·O2ˉ)和羥基(·OH)等。非自由基氧化劑包括過氧化氫(H2O2)、臭氧(O3)和高反應(yīng)性脂質(zhì)或碳水化合物衍生的羰基化合物等[10]。
細胞內(nèi)ROS主要在線粒體和細胞膜上產(chǎn)生。在氧化磷酸化過程中,線粒體活性氧簇 (mitochondrial ROS, mtROS)主要通過線粒體內(nèi)膜上的電子傳遞鏈產(chǎn)生。例如,·O2ˉ是通過線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ的異咯秦半醌(FAD)、泛醌、復合物Ⅲ的細胞色素b566、輔酶Q等還原輔酶或輔基將單個電子轉(zhuǎn)移到氧分子上而產(chǎn)生的[11]。細胞膜上ROS的生成主要由煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase,NOX)介導。NOX由多個蛋白亞基組合而成,位于質(zhì)膜上的亞基被激活后,磷酸化并招募胞內(nèi)亞基,形成有活性的NOX復合體。激活的NOX復合體直接從煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)向游離氧分子轉(zhuǎn)移電子,生成ROS[12-13]。
在NOX家族的7個成員中,破骨細胞主要表達可生成·O2ˉ的NOX1/2和生成H2O2的NOX4[14]。核因子κB受體激活因子配體(receptor activator of NF-κB ligand, RANKL)信號募集和激活TRAF6后,可激活小GTP酶RAC1,其激活后可與NOX1的胞內(nèi)亞基結(jié)合組成復合物,從而激活NOX1,短暫生成ROS[15]。NOX2的質(zhì)膜亞基gp91phox對于生成ROS起重要作用,其敲除小鼠模型的骨髓源性單核巨噬細胞定向分化過程產(chǎn)生破骨分化缺陷表現(xiàn),且可被H2O2補償[16]。Nox4敲除小鼠骨密度較高,破骨細胞數(shù)量和標志物減少[17]。利用基因敲除和敲低技術(shù)相結(jié)合的方法,研究[18]發(fā)現(xiàn)在促破骨細胞分化時,NOX1和NOX2之間存在靈活的代償機制,而NOX4并不參與該代償機制。最新的研究[19]發(fā)現(xiàn),破骨細胞表面的髓系細胞觸發(fā)受體2 (Trem2)是調(diào)節(jié)細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的另一關(guān)鍵分子,其被激活后可與受體DAP12結(jié)合,從而激活酪氨酸激酶Syk,使ROS產(chǎn)生增加。
細胞內(nèi)抗氧化機制可清除ROS,阻止其過量積聚,從而維持細胞內(nèi)ROS的穩(wěn)態(tài)[20]。在抗氧化酶中,最具代表性的是超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD),它通過將·O2ˉ轉(zhuǎn)化為H2O2而降低其活性[21]。由SOD催化產(chǎn)生的H2O2可被過氧化物酶體和細胞漿中的過氧化氫酶(catalase,CAT)轉(zhuǎn)化為水和分子氧[22]。血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)是另一重要的抗氧化酶,其與酶解產(chǎn)物如膽紅素和一氧化碳等共同發(fā)揮抗氧化、抗炎作用[23-24]。HO-1的表達受抗氧化蛋白NRF2所調(diào)控。氧化應(yīng)激條件下,NRF2磷酸化入核與小MAF蛋白組成異源二聚體,與抗氧化反應(yīng)元件(anti-oxidant response element, ARE)結(jié)合,促進HO-1的轉(zhuǎn)錄[25-26]。
在破骨細胞分化過程中,RANKL/核因子κB受體活化因子(receptor activator of nuclear factor-κB,RANK)信號轉(zhuǎn)導通路是調(diào)控破骨前體細胞向破骨細胞分化成熟的關(guān)鍵信號通路[27]。骨髓基質(zhì)細胞和成骨細胞分泌的RANKL與破骨細胞表面RANK結(jié)合后,誘導腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(TNF receptor associated factors,TRAFs)的募集和激活,導致核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB )、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)、轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白1(activator protein-1,AP-1)和AKT等多種信號級聯(lián)反應(yīng)的激活。這些信號級聯(lián)反應(yīng)最終促進活化T細胞核因子1(nuclear factor of activated T-cells cytoplasmic 1,NFATc1)的轉(zhuǎn)錄,進而促進破骨細胞分化和多種溶骨相關(guān)基因如ACP5、CTSK和MMP9等的表達,促使破骨細胞發(fā)生融合、細胞骨架重塑和發(fā)揮骨吸收功能[28-30]。
ROS在破骨細胞分化過程中的調(diào)控作用早在上世紀90年代就有研究。在體外培養(yǎng)誘導分化破骨細胞時無論直接添加H2O2還是SOD誘導產(chǎn)生H2O2均可促進骨吸收[31-32]。后續(xù)發(fā)現(xiàn),砷誘導產(chǎn)生的H2O2促進破骨細胞分化的作用在較低濃度內(nèi)具有劑量依賴性[33]。近期報道[34],破骨細胞內(nèi)抗氧化蛋白NRF2的缺乏增加了砷誘導的H2O2水平和p38的磷酸化。此研究揭示了H2O2濃度上升與破骨細胞內(nèi)MAPK信號通路激活之間的潛在聯(lián)系。隨著ROS檢測技術(shù)的不斷進步,其在細胞內(nèi)的信號調(diào)節(jié)作用不斷被闡明。研究者運用DCFH-DA熒光探針技術(shù)發(fā)現(xiàn),ROS的產(chǎn)生隨著RANKL濃度的增加而增加[35]。隨著H2O2的加入,IκBα 和AKT以及ERK、JNK,、和p38的磷酸化程度呈劑量依賴性增加[35]。Satish Srinivasan等[36]利用電子自旋共振(electron paramagnetic resonance,EPR)捕獲技術(shù),發(fā)現(xiàn)微缺氧條件下,ROS產(chǎn)生增加,IκBβ水平下降,破骨細胞分化增強,且可被抗氧化劑逆轉(zhuǎn)。在一項糖尿病引起骨質(zhì)疏松的機制研究[37]報道中,研究者發(fā)現(xiàn),體外利用高糖培養(yǎng)基來培養(yǎng)破骨細胞,可使ROS的產(chǎn)生增加,導致ERK、JNK和p38及IκB的磷酸化加強,并上調(diào)IKK,從而增強破骨細胞分化。綜上,隨著ROS檢測技術(shù)的進步和H2O2與高糖培養(yǎng)基質(zhì)及微缺氧培養(yǎng)條件的建立,ROS通過NF-κB、MAPK和AKT等多條信號通路調(diào)控破骨細胞分化的機制逐漸被闡明[38-39]。研究[40]顯示,以上信號通路中,磷酸化酶催化位點處的半胱氨酸解離常數(shù)(pKa )較低,主要以硫醇形式存在,可被ROS進行氧化修飾從而影響該酶的催化活性。而在破骨細胞中,ROS對于多條信號通路的調(diào)控是否通過半胱氨酸的氧化修飾來實現(xiàn)還未有研究。
除調(diào)控破骨細胞分化外,ROS也可能參與破骨細胞凋亡調(diào)控。據(jù)報道,含氮雙膦酸唑與原兒茶酸均可下調(diào)ROS并誘導破骨細胞凋亡,而香煙煙霧提取物可激活ROS并抑制破骨細胞凋亡[41-43]。但目前ROS調(diào)控破骨細胞凋亡的分子機制還不清楚,且以上研究與激活ROS促進腫瘤細胞凋亡的研究結(jié)果[44]不一致,故ROS在破骨細胞凋亡中的調(diào)控作用及機制還有待進一步研究。
由于ROS可通過多條信號通路調(diào)控破骨細胞的分化成熟,故將ROS作為靶點的抗氧化劑對于溶骨性疾病的治療研究也常有報道。研究[45]發(fā)現(xiàn),老年人和女性人群的血漿中,抗氧化劑的含量明顯減少。在卵巢切除小鼠中應(yīng)用N-乙酰半胱氨酸(NAC)或抗壞血酸鹽等抗氧化劑可以減少雌激素下降引起的骨丟失[46]。一些回顧性隊列研究[47-50]發(fā)現(xiàn),服用常見抗氧化劑如維生素C、維生素E、 NAC和硫辛酸(LA)的人群骨密度(bone mineral density,BMD)相對較高。
近年來,眾多新型抗氧化劑顯現(xiàn)出對破骨細胞分化成熟的靶向抑制作用,有望為骨質(zhì)疏松癥等溶骨亢進型疾病提供治療新思路。根據(jù)其抗氧化作用原理不同,可將這些抗氧化劑分為兩大類,即抑制ROS產(chǎn)生型和促進ROS代謝型(表1)。
表1 新型抗氧化劑對于破骨細胞分化成熟的靶向調(diào)控Table 1 Targeting effects of novel antioxidants on osteoclast differentiation and maturation
抑制ROS產(chǎn)生型抗氧化劑包括米托蒽醌甲磺酸鹽(MitoQ)、木黃酮和葛根素和阿齊沙坦等,主要通過抑制ROS的產(chǎn)生,從而抑制破骨細胞分化。例如,MitoQ是一種線粒體特異性抗氧化劑,其可抑制缺氧環(huán)境下的mtROS的產(chǎn)生,從而通過抑制NF-κB信號通路來抑制破骨細胞分化[36];木黃酮通過抑制NOX1的翻譯和激活來減少破骨細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生從而抑制破骨細胞形成[7];葛根素通過下調(diào)TRAF6和NOX1的表達,抑制TRAF6/ROS依賴的MAPK和NF-κB信號通路,從而抑制破骨細胞分化[8]。近期[51]發(fā)現(xiàn),一種血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑阿齊沙坦可下調(diào)NRF2的表達以抑制ROS 的產(chǎn)生,來抑制MAPK和NF-κB信號通路,從而抑制破骨分化。
促進ROS代謝型抗氧化劑包括姜黃素、髓過氧化物酶和白樺提取物BAG等,主要通過促進ROS代謝分解,從而抑制破骨細胞分化。例如,姜黃素可上調(diào)NRF2的表達并增強SOD和CAT活性而促進ROS的代謝,通過NF-κB/AKT信號通路來抑制NFATc1的表達,從而抑制破骨細胞分化成熟[52-54]。姜黃素環(huán)糊精包合物與金納米制劑聯(lián)用在體外證實可提高卵巢切除誘導骨質(zhì)疏松模型的骨密度[55]。一期臨床試驗[56]結(jié)果表明,姜黃素可提高骨密度和減少骨吸收,對骨質(zhì)疏松過程有抑制作用。姜黃素和阿侖膦酸鹽聯(lián)合治療可調(diào)節(jié)骨質(zhì)疏松絕經(jīng)后婦女的骨轉(zhuǎn)換標志物并提高骨密度[57]。髓過氧化物酶通過分解細胞內(nèi)H2O2,抑制破骨細胞發(fā)生和骨吸收[58]。有H2O2暴露時,輔酶Q10可提高SOD和CAT酶活性及氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達來加速ROS代謝,以抑制RANKL誘導的破骨細胞分化[59]。
本文總結(jié)了ROS在破骨細胞分化成熟過程中的調(diào)控作用。破骨細胞在分化過程中伴隨著ROS的產(chǎn)生,ROS通過調(diào)節(jié)NF-κB、MAPK和AKT信號通路,促進破骨細胞分化成熟。將ROS作為靶點的常見抗氧化劑可作為治療溶骨性疾病的全新方向。近年來,多種新型抗氧化劑特異性靶向ROS產(chǎn)生和代謝酶類,通過抑制ROS產(chǎn)生或促進ROS代謝從而抑制溶骨作用,為溶骨亢進型疾病治療藥物的研發(fā)提供了新思路。
盡管不同抗氧化劑均通過降低破骨細胞的ROS水平,從而抑制破骨細胞分化,但其所調(diào)控的信號通路卻有所不同,這其中的機理還未有研究。雖然在眾多新型抗氧化劑治療溶骨性疾病研究中的大部分仍處于基礎(chǔ)研究和早期臨床試驗階段,但由于靶向分子的多樣性以及調(diào)控信號通路的可選擇性,使其在精準醫(yī)療中具有巨大潛力。