薛黎明 董志敏 金玉娥 蔣益萍 Dieter Br?mme

1.上海市疾病預防控制中心，上海 200336

2.上海師范大學，上海 200234

3.中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學，上海 200433

4.不列顛哥倫比亞大學，溫哥華V6T1Z3，加拿大

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是一種常見的發(fā)病率高、致殘率高的骨骼疾病，給我國帶來沉重的社會和經濟負擔。臨床治療骨質疏松藥物，若長期使用多存在不良反應，如常用骨吸收抑制劑雙膦酸鹽可顯著下調或者破壞破骨細胞，但會影響破骨細胞和成骨細胞的相互作用信號機制，導致骨形成減少[1]。組織蛋白酶K(Cathepsin K，CTSK)抑制劑是抗骨質疏松癥新藥研發(fā)的熱點之一，臨床前和臨床研究數據表明CTSK抑制劑可特異性地抑制破骨細胞膠原降解酶的活性，而不影響破骨細胞活力，可以有效避免成骨細胞和破骨細胞雙向調節(jié)的失衡[2]。

傳統(tǒng)中藥含有豐富的促進骨形成和抑制骨吸收的活性物質，如我國臨床原發(fā)性骨質疏松診療指南中記錄骨碎補總黃酮、淫羊藿苷等[3]。多種中藥有效部位及中藥復方，如骨碎補總黃酮、杜仲醇提取物、復方甘草附子湯、補腎通絡方等[4-6]均報道具有抑制CTSK活性。目前僅有少量中藥來源的CTSK抑制劑的研究，本文擬通過查詢中國知網、萬方和Web of Science數據庫所收錄的CTSK抑制劑分類、單味中藥來源CTSK抑制劑的研究進展，以期為中藥中開發(fā)安全、有效的CTSK抑制劑藥物提供思路。

1 組織蛋白酶K概述

CTSK屬于番木瓜蛋白酶家族，與組織蛋白酶B、L和S具有高度同源性，主要分布在骨組織，它特異性表達于破骨細胞邊緣褶皺處，其作用底物主要是骨基質中含量達 90%以上的Ⅰ型膠原，還可降解骨基質中Ⅱ型膠原、骨橋接素和骨連接素等蛋白，是破骨細胞中溶骨活性最強的關鍵酶[7]。CTSK基因表達的變異或缺失會導致患者患致密性成骨不全癥、骨質疏松癥和骨脆性骨折增加等疾病[8]。除了骨組織，CTSK在皮膚、心臟、骨骼肌、胎盤、小腸、肺、大腦和甲狀腺等組織中均有表達，發(fā)揮著重要的生理作用。CTSK基因缺失可引起肺纖維化、呼吸、心血管、免疫系統(tǒng)功能障礙、甲狀腺功能異常、癌癥、甚至學習記憶缺陷等癥[9]。

2 組織蛋白酶K抑制劑

2.1 活性位點抑制劑

基于CTSK與抑制劑共培養(yǎng)復合物的晶體結構解析，發(fā)現CTSK分子活性位點位于頂部的一個V形裂縫，結構域由Cys25、His162和Asn161等氨基酸殘基組成(見圖1)[10]，它含有催化二氫半胱氨酸-組氨酸結構，可以接受脯氨酸殘基，這與膠原蛋白中脯氨酸和羥脯氨酸殘基的高含量有關[11]。CTSK在酸性環(huán)境中，通過自動斷開其前端部分而暴露其催化活性位點，直接作用于膠原端肽區(qū)，將完整的三股螺旋體結構膠原蛋白降解成不規(guī)則結構的纖維碎片[11]。目前制藥企業(yè)研發(fā)CTSK抑制劑均是針對活性位點開發(fā)的，通過直接競爭性與CTSK活性位點結合，抑制CTSK活性，稱為活性位點抑制劑(active site inhibitor)。迄今為止，有50多種CTSK抑制劑藥物申請了專利，但都在臨床前或臨床試驗階段宣告失敗，其失敗原因與導致非骨骼組織嚴重不良反應密切相關[2]。

2.2 非活性位點抑制劑

CTSK與粘多糖(glycosaminoglycans，GAGs)，如硫酸軟骨素(CSA)，結合后可形成一種CTSK-GAGs復合物，只有這種復合物形成，CTSK才能夠發(fā)揮膠原酶活性，如果GAGs缺失，CTSK將失去膠原酶活性，但仍保留CTSK的其他正常肽酶活性[10]。非活性位點抑制劑(Ectosteric-site inhibitor)不是競爭性抑制三螺旋膠原與CTSK的結合，而是競爭性抑制CTSK與GAGs結合的寡聚化位點，GAG-CTSK結合位點G1含K119、K122、R123和R127殘基，結合位點G2含K40、K41、R108、R111和K214殘基[12](圖1)。Sharma等[13]在人CTSK(1ATK)蛋白分子上鑒定了非活性位點1的結構域由一個由Y87、E93和E94的鉤狀環(huán)形成(圖1)[13]。Novinec等[14]報道在CTSK(1ATK)分子上鑒定到非活性位點2，其位置毗鄰與于GAGs位點，結構域內含有K119、N199、R198、K176、Y169、R123和K122殘基(圖1)，除該位點外，還預測了CTSK分子可能還存在6個潛在的CTSK變構作用位點[14]。目前基于非活性位點抑制劑的研究，都來自傳統(tǒng)中藥的活性物質。

圖1 組織蛋白酶K變構位點位置和結構域。黃色：活性位點[10]；綠色：非活性位點1[13]；粉紅色：GAG位點[12]；青色：非活性位點2[14]Fig.1 Location and binding pocket of allosteric sites on cathepsin K. Yellow： active site [10], Green： Ectosteric site 1[13], Pink： GAG site[12], and Cyan： Ectosteric site 2[14]

3 單味中藥及其有效成分CTSK抑制劑研究

3.1 丹參

丹參具有活血祛瘀、通經止痛、清心除煩、涼血消癰之功效，臨床主要用于預防和治療心腦血管疾病。Guo等[15]綜述了傳統(tǒng)中藥丹參治療骨質疏松的臨床應用，超過30%的中藥方劑包含丹參。發(fā)現丹參乙醇提取物顯著抑制膠原降解，而不影響CTSK降解活性位點合成底物Z-FR-MCA，故推測丹參乙醇提取物可能含有CTSK非活性位點抑制劑。Preety等[16]研究丹參中30多種丹參酮類成分進行膠原酶活性，結果發(fā)現6種丹參酮化合物抗膠原酶IC50值均小于500 nmol/L，能顯著抑制破骨細胞骨吸收活性，但對破骨細胞活力和骨形成活性無影響，被認為是較為理想的非活性位點抑制劑[17]。其中二氫丹參酮I(DHT1)和丹參酮ⅡA磺酸鈉的抗膠原酶活性IC50為(6.2±0.7)μmol/L和(2.7±0.2)μmol/L，接近默克odanacatib的(0.21±0.05)μmol/L，對CTSK活性位點底物明膠、甲狀腺球蛋白和轉化生長因子(TGF-β)沒有抑制作用[13,18]。分子對接結果發(fā)現DHT1結合在CTSK非活性位點1中Tyr87、Pro88和Val90氨基酸殘基形成的溝狀結構，與Asn99殘基氫鍵相互作用[13]。丹參酮ⅡA磺酸鈉也同樣與活性位點1結構裂縫相吻合，與Glu94和Ser95形成氫鍵相互作用，與Tyr87、Pro88和Met97的疏水殘基相互作用，其對接得分最高，原因可能是由于含有一個磺酸根基團且?guī)в须姾墒蛊浣Y合更緊密[18]。最新臨床研究發(fā)現丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液可有效治療骨質疏松和術后骨折[19-20]。

3.2 淫羊藿

淫羊藿，又名仙靈脾，具有補腎陽、強筋骨、祛風濕的功效，為中醫(yī)補腎壯骨的代表藥材，其活性部位淫羊藿總黃酮和成分淫羊藿苷臨床證實對治療骨質疏松效果顯著[3,21]。戴娜桑等[22]研究發(fā)現10 μmol/L淫羊藿苷就可以顯著抑制CTSK降解膠原活性，1 mmol/L淫羊藿苷對CTSK活性位點熒光底物A-H-D-ALK-AMC具有明顯的抑制作用，抑制率高達75.34%。Sun等[23]采用SDS-PAGE方法考察淫羊藿苷降解膠原作用，結果發(fā)現淫羊藿苷在5 μmol/L濃度時，顯著抑制膠原降解，其呈劑量依賴性，推測是一種有效的CTSK抑制劑。但Xue等[24]研究報道濃度高達100 μmol/L的淫羊藿苷對CTSK降解膠原和合成底物Z-FR-MCA無任何抑制作用。

3.3 墨旱蓮

墨旱蓮，具有滋補肝腎，涼血止血功效，適用于肝腎陰虛，牙齒松動等癥，與女貞子組方二至丸臨床用于治療骨質疏松。墨旱蓮乙醇提取物(EAE)和活性成分蟛蜞菊內脂報道能抑制破骨細胞分化和下調骨吸收標記基因c-src和CTSK表達[25-26]。蔣益萍等[27]研究了墨旱蓮正丁醇、乙酸乙酯、石油醚和二氯甲烷提取物對CTSK降解膠原和合成底物Z-FR-MCA活性的影響，結果發(fā)現墨旱蓮石油醚和正丁醇部位的膠原降解抑制率分別為95.6%和78.3%，而與Z-FR-MCA結合的抑制率分別為72.3%和25.9%，說明墨旱蓮正丁醇部位可能存在潛在非活性位點抑制劑。正丁醇部位化學成分墨旱蓮皂苷V、I、Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ和刺囊酸6個成分對Z-FR-MCA底物結合活性均無抑制作用，僅墨旱蓮皂苷Ⅸ在100 μmol/L顯著抑制CTSK膠原酶活性，抑制率為70.3%，推測墨旱蓮皂苷Ⅸ可能為潛在的非活性位點抑制劑。

3.4 補骨脂

補骨脂，具有溫腎助陽、納氣平喘、溫脾止瀉之功效，藥理活性表現為抗腫瘤、抗菌、抗骨質疏松、雌激素作用等。丁黎艷等[28]對補骨脂33種化學成分與人CTSK蛋白分子(3KWZ)的活性位點結構域進行分子對接，發(fā)現有8個與CTSK具有較高親和力，均存在兩個疏水基團與CTSK活性位點的疏水空穴結合。其中6個是黃酮類化合物，推測原因為黃酮6C-3C-6C的基本骨架，3C烯酮結構，空間位阻小，易于CTSK活性位點凹槽位置較好吻合，烯酮中的羰基氧或6C骨架上的羥基易于Cyr25殘基形成氫鍵。因此，補骨脂可能含有多個CTSK抑制劑，通過多成分協(xié)同抑制骨吸收作用。但是，近年來補骨脂及抗骨質疏松活性成分補骨脂素、異補骨脂素和補骨脂酚等均報可能引起肝損傷，臨床使用需予以注意[29]。

3.5 其他

王丹華[30]分別構建了人CTSK(4x6i)蛋白分子活性位點結構和CTSK變種(5j94)[14]的別構位點藥效團模型，對由淫羊藿、續(xù)斷、補骨脂、知母、丹參和地黃組成的中成藥仙靈骨葆膠囊中活性化合物進行分子對接，分別得到98個和75個化合物對接成功，且分別展示了活性位點和別構位點綜合評分最佳的9個化合物，多以苯丙素、黃酮、環(huán)烯醚萜苷和三萜結構骨架類型化合物為主。仙靈骨葆膠囊是臨床常用于治療骨質疏松中成藥，推測可能是存在多種CTSK抑制劑協(xié)同發(fā)揮作用。

4 展望

臨床治療骨質疏松中藥是理想的CTSK抑制劑候選庫，具療效確切且不良反應小的優(yōu)點。中藥中可能不僅含有CTSK抑制劑降低骨吸收，同時也存在促進骨形成活性成分，二者組合協(xié)同發(fā)揮療效。甚至篩查到的CTSK抑制劑，除了抑制骨吸收，還可能促進骨形成活性，表現出多靶點調控骨代謝，如淫羊藿苷雙向調節(jié)骨形成和骨吸收作用，多靶點調控作用也可能降低其作為CTSK活性位點抑制劑的不良反應。這種中藥的整體觀組合治療或多靶點作用的思路，可能是中藥臨床發(fā)揮抗骨質疏松的重要作用機理。

CTSK非活性位點抑制劑不僅發(fā)揮CTSK降解骨膠原的活性，且不會影響其在其他組織的正常生理活性，是潛在的理想型CTSK抑制劑藥物研發(fā)的新方向。從中藥中篩選CTSK非活性位點抑制劑，不存在臨床試驗發(fā)現的活性位點抑制劑的安全性問題。