陳玄 陳娟 謝麗華 李生強(qiáng) 黃景文 葉云金 陳賽楠 黃小彬 葛繼榮*

1.福建省中醫(yī)藥科學(xué)院骨質(zhì)疏松證候基因組學(xué)重點(diǎn)研究室，福建 福州350003

2.福建省中西醫(yī)結(jié)合防治骨質(zhì)疏松重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建省中醫(yī)藥科學(xué)院及福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院，福建 福州 350003

近年來(lái)中醫(yī)藥治療骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)的臨床效果已得到廣泛認(rèn)同和肯定。骨碎補(bǔ)、續(xù)斷是中醫(yī)治療OP的常用藥物之一，其中骨碎補(bǔ)位于OP治療最高頻次用藥前3名，續(xù)斷則位居OP藥物組方的高頻次用藥前十[1]。在治療OP的中藥復(fù)方中，骨碎補(bǔ)、續(xù)斷常常配伍使用，包括經(jīng)典名方續(xù)骨活血湯和眾多臨床經(jīng)驗(yàn)方，如骨保合劑[2]、補(bǔ)腎強(qiáng)督方[3]、補(bǔ)腎通絡(luò)湯[4]等。筆者在前期研究中也發(fā)現(xiàn)，以骨碎補(bǔ)、續(xù)斷為君藥的課題組經(jīng)驗(yàn)方續(xù)苓健骨方具有改善絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松(postmenopausal osteoporosis，PMOP)患者和去卵巢(ovariectomy，OVX)大鼠的骨密度、骨生物力學(xué)指標(biāo)、骨組織微結(jié)構(gòu)、血液鈣磷代謝的作用[5-7]。因此，骨碎補(bǔ)-續(xù)斷配伍治療OP具有廣泛的實(shí)踐基礎(chǔ)和良好的應(yīng)用前景。

目前，骨碎補(bǔ)和續(xù)斷的粗提物已被分別開(kāi)發(fā)成中藥二類(lèi)新藥——強(qiáng)骨膠囊[8]和續(xù)斷壯骨膠囊[9]，可直接用于治療OP，但有關(guān)骨碎補(bǔ)-續(xù)斷藥對(duì)的療效和機(jī)制的研究仍寥寥無(wú)幾。有必要了解骨碎補(bǔ)-續(xù)斷藥對(duì)用于治療OP的效果如何？其療效的發(fā)揮是通過(guò)調(diào)控成骨代謝還是破骨代謝，或二者兼而有之？本研究擬通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分別觀(guān)察骨碎補(bǔ)-續(xù)斷藥對(duì)對(duì)成骨代謝和破骨代謝的調(diào)控作用，并初步探討其作用靶點(diǎn)和機(jī)制，為骨碎補(bǔ)-續(xù)斷配伍用于治療OP提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：3月齡SPF級(jí)雄性SD大鼠40只，購(gòu)自杭州醫(yī)學(xué)院。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(浙)2019-0002。大鼠在20 ℃～25 ℃，濕度65%～70%，光照12 h/12 h的環(huán)境中飼養(yǎng)，給予標(biāo)準(zhǔn)鼠飼料和自由飲水。

1.1.2實(shí)驗(yàn)細(xì)胞：小鼠顱頂前成骨細(xì)胞亞克隆14(MC3T3-E1 subclone14)細(xì)胞株，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)(貨號(hào)GNM15)；小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞(RAW264.7)，購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)(貨號(hào)TIB-71)。

1.1.3實(shí)驗(yàn)藥物：骨碎補(bǔ)(黃岡金貴中藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司，批號(hào)D9100102)、續(xù)斷(廈門(mén)燕來(lái)福制藥有限公司，批號(hào)180517)，購(gòu)自鷺燕醫(yī)藥股份有限公司。

1.1.4試劑：DMEM高糖減血清培養(yǎng)基(源培生物，Cat．#L180KJ )；胎牛血清(BI公司，Cat．#04-001-1B)；β-甘油磷酸鈉、地塞米松、抗壞血酸磷酸鹽、RANKL(Cat．#R0525)、茜素紅染料(Alizarin red)等試劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；CCK-8 試劑盒(Abmole公司，Cat. # M4839)；TRAP/ALP染色試劑盒(日本和光純藥公司，Cat．#294-67001)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara公司，Cat．#639505)；熒光定量PCR試劑盒(Takara公司，Cat．# DRR041 A)；引物由Takara 公司合成；Western-blot主要試劑購(gòu)自碧云天公司；HIF1ɑ抗體(Abcam公司，Cat．#ab179483)。

1.1.5儀器：超微量核酸測(cè)定儀Nano2000 (Thermo Fisher公司)；熒光定量PCR儀7500 FAST(美國(guó)ABI公司)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo Fisher公司)；倒置相差顯微鏡DM40000 B(Leica公司)；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(ThermoFisher Scientific)；多色熒光/化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國(guó)FluorchemM公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組及骨碎補(bǔ)-續(xù)斷含藥血清的制備：40只大鼠隨機(jī)分成空白含藥血清組(空白組)、骨碎補(bǔ)-續(xù)斷低劑量含藥血清組(低劑量組)、中劑量含藥血清組(中劑量組)、高劑量含藥血清組(高劑量組)，每組10只。骨碎補(bǔ)-續(xù)斷按1∶1比例配伍制成水煎劑，根據(jù)動(dòng)物與人體的每千克體質(zhì)量劑量折算系數(shù)折算，骨碎補(bǔ)-續(xù)斷的人體用藥量為0.6 g/(kg·d)，低劑量組大鼠用藥量則為6.25×0.6=3.75 g/(kg·d)，中劑量組為3.75×3=11.25 g/(kg·d)，高劑量組為3.75×6=22.5 g/(kg·d)。各組分別灌胃給藥，每天2次，連續(xù)7 d，空白組給予等量生理鹽水。末次給藥后1 h，腹腔注射戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉，腹主動(dòng)脈采血10～15 mL。分離血清，同組動(dòng)物血清合并，56 ℃水浴30 min滅活，過(guò)濾除菌，-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)：MC3T3-E1和RAW264.7細(xì)胞分別以基礎(chǔ)培養(yǎng)基(DMEM高糖培養(yǎng)基+10%胎牛血清)培養(yǎng)，隔2 d換液。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，根據(jù)分組，分別添加10%的含藥血清進(jìn)行干預(yù)。

1.2.3CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞以2×103cells /100 μL的密度接種于96孔培養(yǎng)板，每板設(shè)空白孔，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。按分組加入血清，分別培養(yǎng)0、24、48、72、96、120 h后，每孔加入10 μL的CCK8，37 ℃孵育3 h，檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處OD值。

1.2.4ALP/TRAP染色：MC3T3-E1細(xì)胞用成骨誘導(dǎo)劑(50 μg/mL抗壞血酸磷酸鹽，10 mmol /Lβ甘油磷酸鈉，10 nmol/L地塞米松)誘導(dǎo)，隔天半量換液。誘導(dǎo)7 d后，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗，0.5 mL固定液冰上固定10 min。RAW264.7細(xì)胞用50 ng/mL的RANKL誘導(dǎo)破骨分化，3 d換液1次，誘導(dǎo)5 d后，同法固定。PBS清洗3次，加入250 μL的ALP或TRAP染色液，37 ℃避光孵育40 min，dH2O清洗3次，光鏡下觀(guān)察拍照。

1.2.5茜素紅染色：成骨誘導(dǎo)分化14 d，棄成骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基，PBS清洗2次；每孔加2 mL的4%多聚甲醛溶液，固定30 min；棄多聚甲醛溶液，PBS清洗2次；每孔加入1 mL茜素紅染液染5～10 min；棄茜素紅染液，PBS清洗2次，光鏡下觀(guān)察拍照。

1.2.6系統(tǒng)藥理學(xué)的方法分析藥物可能作用靶點(diǎn)：通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分享平臺(tái)(TCMSP、BATMAN-TCM、TCMID等數(shù)據(jù)庫(kù))，篩選出骨碎補(bǔ)-續(xù)斷藥對(duì)的生物利用度≥30%，類(lèi)藥性≥0.18的有效化學(xué)成分。從PubChem、HIT、BindDB等數(shù)據(jù)庫(kù)獲取經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的上述有效化學(xué)成分的靶點(diǎn)；并利用反向分子對(duì)接技術(shù)，利用DRAR-CPI數(shù)據(jù)庫(kù)和systemsDock在線(xiàn)分子對(duì)接工具預(yù)測(cè)化學(xué)成分的潛在作用靶點(diǎn)。從TTD數(shù)據(jù)庫(kù)和DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)獲取疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)。應(yīng)用Cytoscape軟件將上述成分-靶點(diǎn)數(shù)據(jù)構(gòu)建成成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)行優(yōu)化和渲染。根據(jù)自由度等參數(shù)提取其核心成分和靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.2.7實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)：TriZol法提取RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。配制如下熒光定量PCR反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex TaqTM GC 12.5 μL，引物各0. 5 μL，dH2O 9.5 μL，cDNA 2 μL。經(jīng)95 ℃預(yù)變性10 s后；95 ℃ 5 s→60 ℃ 31 s，反應(yīng)40個(gè)循環(huán)。引物序列見(jiàn)表 1，采用2-ΔΔCT法計(jì)算缺氧誘導(dǎo)因子(Hypoxia-inducible factor 1-alpha，Hif1ɑ)的mRNA表達(dá)水平。

表1 熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer pairs used in real-time PCR

1.2.8免疫蛋白印跡法(Western-blot)：收集細(xì)胞，提取總蛋白。經(jīng)SDS-PAGE電泳將不同分子量的蛋白分離后，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移到NC膜上，脫脂奶粉封閉，孵育一抗，二抗，而后ECL顯色。采用化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)觀(guān)察并拍照后，Image-Pro Plus 圖像分析軟件分析目標(biāo)條帶的灰度，并計(jì)算細(xì)胞中的HIF1ɑ和內(nèi)參蛋白濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用重復(fù)測(cè)量的方差分析，統(tǒng)計(jì)具有差異時(shí)再以Bonferroni 法進(jìn)行組間多重比較；兩組間比較采用兩樣本t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨碎補(bǔ)-續(xù)斷對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖和成骨分化的影響

觀(guān)察不同濃度的骨碎補(bǔ)-續(xù)斷含藥血清處理細(xì)胞1、2、3、4、5 d的細(xì)胞增殖倍數(shù)，發(fā)現(xiàn)與空白組相比，低劑量組的細(xì)胞增殖速度沒(méi)有明顯差別；而中、高劑量組細(xì)胞從第3天開(kāi)始，細(xì)胞增殖速度快于空白組(P<0.05)，且隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，增殖速度進(jìn)一步加快；中劑量組與高劑量組相比，二者沒(méi)有明顯差異(圖1A)。進(jìn)一步觀(guān)察中劑量和高劑量的骨碎補(bǔ)-續(xù)斷含藥血清對(duì)細(xì)胞成骨潛能和鈣化能力的影響，中、高劑量組細(xì)胞的ALP染色和茜素紅染色程度均明顯高于空白組，中劑量組和高劑量組之間未見(jiàn)明顯差別(圖1B和1C)。

圖1 含藥血清對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的增殖(A)、ALP染色(B，40×)和茜素紅染色(C)的影響Fig.1 Effects of drug-containing serum on MC3T3-E1 cells proliferation(A), ALP staining (B，40×), and Alizarin red staining(C)

2.2 骨碎補(bǔ)-續(xù)斷對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖和破骨分化的影響

觀(guān)察不同濃度的骨碎補(bǔ)-續(xù)斷含藥血清處理細(xì)胞1、2、3、4、5 d的細(xì)胞增殖倍數(shù)，發(fā)現(xiàn)與空白組相比，低劑量組的細(xì)胞增殖速度略有降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而中、高劑量組細(xì)胞從第3天開(kāi)始，細(xì)胞增殖速度明顯降低(P<0.01)，且隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，細(xì)胞增殖被進(jìn)一步抑制；中劑量組與高劑量組相比，二者沒(méi)有明顯差異(圖2A)。觀(guān)察RAW264.7分化為破骨細(xì)胞的能力，發(fā)現(xiàn)中、高劑量組細(xì)胞的TRAP染色水平明顯低于空白組，中劑量組和高劑量組之間沒(méi)有明顯差別(圖2B)。

圖2 含藥血清對(duì)RAW264.7細(xì)胞的增殖(A)和TRAP染色(B)的影響(200×)Fig.2 Effects of drug-containing serum on RAW264.7 cells proliferation(A)and TRAP staining(B)(200×)

2.3 HIF1ɑ可能是骨碎補(bǔ)-續(xù)斷的作用靶點(diǎn)之一

采用系統(tǒng)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)，分析骨碎補(bǔ)-續(xù)斷藥對(duì)治療OP的已驗(yàn)證或預(yù)測(cè)的分子靶點(diǎn)及相應(yīng)的藥物活性成分，并通過(guò)自由度(≥5)篩選出核心作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果顯示，骨碎補(bǔ)和續(xù)斷分別有14和8個(gè)核心活性成分，其中甾醇(beta-sitosterol)是骨碎補(bǔ)和續(xù)斷共有的活性成分。活性成分的已驗(yàn)證或經(jīng)預(yù)測(cè)的作用靶點(diǎn)共有包括HIF1ɑ在內(nèi)的43個(gè)。其中有8個(gè)藥物的活性成分可作用于HIF1ɑ(表2)。

表2 可能作用于Hif1ɑ基因的骨碎補(bǔ)-續(xù)斷活性成分Table 2 Active ingredients of the herbs that may act on Hif1ɑ gene

2.4 骨碎補(bǔ)-續(xù)斷對(duì)MC3T3-E1和RAW264.7細(xì)胞Hif1ɑ基因表達(dá)水平的影響

檢測(cè)中劑量骨碎補(bǔ)-續(xù)斷含藥血清處理的MC3T3-1和RAW264.7細(xì)胞的Hif1ɑ表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)MC3T3-1細(xì)胞中的Hif1ɑ基因的mRNA和蛋白水平均明顯升高(P<0.01)；RAW264.7細(xì)胞的Hif1ɑ基因的mRNA 水平?jīng)]有明顯改變(P>0.05)，但蛋白水平明顯提高(P<0.01)，見(jiàn)圖3。

圖3 含藥血清對(duì)MC3T3-E1和RAW264.7細(xì)胞的Hif1ɑ基因的mRNA和蛋白水平的影響(**P<0.01)Fig.3 Effects of drug-containing serum on mRNA and protein expression levels of Hif1ɑ gene in MC3T3-E1 and RAW264.7 cells (**P<0.01)

3 討論

雖然目前骨碎補(bǔ)-續(xù)斷配伍廣泛應(yīng)用于中醫(yī)藥臨床治療OP，但是有關(guān)二者聯(lián)合使用的具體效果和作用機(jī)制的研究仍然十分匱乏。在改善大鼠骨折方面，將骨碎補(bǔ)總黃酮與續(xù)斷總皂苷1∶1配伍用藥，發(fā)現(xiàn)骨碎補(bǔ)是產(chǎn)生療效的主要原因，而與續(xù)斷的配伍產(chǎn)生了協(xié)同效應(yīng)，其療效優(yōu)于二者分別單獨(dú)使用的效果[10]。骨碎補(bǔ)、續(xù)斷、續(xù)斷與骨碎補(bǔ)混合水煎液(1∶1)都具有增強(qiáng)MC3T3-E1成骨細(xì)胞的增殖作用，并且與續(xù)斷聯(lián)合使用具有降低骨碎補(bǔ)對(duì)細(xì)胞的毒性作用，但骨碎補(bǔ)、續(xù)斷及其混合液的促成骨代謝作用研究未進(jìn)一步觀(guān)察[11]。

目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)骨碎補(bǔ)-續(xù)斷藥對(duì)在調(diào)控成骨和破骨代謝方面作用的研究發(fā)表。本研究結(jié)果表明，中、高劑量的骨碎補(bǔ)-續(xù)斷含藥血清不僅可促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞的增殖，還提高其成骨分化和礦化能力，促進(jìn)成骨代謝；還可明顯抑制RAW264.7細(xì)胞的增殖和分化，抑制破骨代謝。

為了進(jìn)一步探討骨碎補(bǔ)-續(xù)斷調(diào)控骨代謝的分子機(jī)制，本研究預(yù)測(cè)和驗(yàn)證了藥物的可能作用靶點(diǎn)，其中包括HIF1ɑ。課題組前期對(duì)PMOP患者治療前后的外周血細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，PMOP患者的HIF1ɑ的mRNA水平明顯下降，而以骨碎補(bǔ)-續(xù)斷為君藥的續(xù)苓建骨方治療后，HIF1ɑ的mRNA水平明顯提高[7]。此外，使用含骨碎補(bǔ)、續(xù)斷等藥物的補(bǔ)腎通絡(luò)湯[4]治療PMOP大鼠后，也同樣發(fā)現(xiàn)HIF1ɑ的表達(dá)水平明顯增高。提示HIF1ɑ可能是骨碎補(bǔ)-續(xù)斷藥對(duì)的核心作用靶點(diǎn)之一。

HIF1ɑ是氧分壓感傳信號(hào)通路上的一個(gè)關(guān)鍵分子，許多研究也表明，HIF1ɑ作為轉(zhuǎn)錄因子，在骨代謝調(diào)控中具有重要作用[12-13]。在骨骼發(fā)育、骨代謝動(dòng)態(tài)平衡、骨再生和病理狀態(tài)等不同條件下，在成骨前體細(xì)胞或成骨細(xì)胞內(nèi)增強(qiáng)HIF1ɑ的表達(dá)，可明顯促進(jìn)骨形成[14-15]。而在骨細(xì)胞內(nèi)選擇性敲除HIF1ɑ，小鼠的骨小梁體積和數(shù)量明顯減少[16]。在軟骨細(xì)胞內(nèi)選擇性敲除HIF1ɑ，小鼠的軟骨內(nèi)成骨能力受損，新生骨小梁的密度和厚度都降低[17]。此外，在骨細(xì)胞內(nèi)選擇性敲除Fra-2基因，HIF1ɑ水平明顯提高時(shí)，除了成骨活性的增加，小鼠骨組織切片還觀(guān)察到了許多功能、形態(tài)異常的巨型破骨細(xì)胞[18]。在成骨和骨細(xì)胞內(nèi)敲除PHD2基因，一種調(diào)節(jié)HIF1ɑ蛋白的穩(wěn)定性的基因，細(xì)胞核內(nèi)聚集的HIF1ɑ數(shù)量明顯增加，小鼠骨小梁數(shù)量和體積，成骨細(xì)胞數(shù)量及骨形成能力都明顯提升。同時(shí)，破骨細(xì)胞的數(shù)量及破骨代謝標(biāo)志物的水平也明顯降低[15]。這些研究表明，HIF1ɑ既能調(diào)控骨形成，又能調(diào)控骨吸收。

骨碎補(bǔ)、續(xù)斷均歸肝、腎經(jīng)。骨碎補(bǔ)能活血續(xù)傷，兼溫補(bǔ)腎陽(yáng)。續(xù)斷則以補(bǔ)腎陽(yáng)為主，兼活血化瘀。中醫(yī)認(rèn)為，“陽(yáng)化氣，陰成形”是機(jī)體能量代謝和物質(zhì)轉(zhuǎn)化的一個(gè)動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，通過(guò)補(bǔ)陽(yáng)促進(jìn)“陽(yáng)化氣”可以調(diào)節(jié)能量代謝[19]。另一方面，研究已證明，中藥活血化瘀的功能與其促進(jìn)血管新生，提高細(xì)胞耐缺氧能力有密切關(guān)系[20]。作為缺氧應(yīng)答中最為關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，HIF1ɑ在調(diào)控細(xì)胞能量代謝、血管生成等方面具有重要作用[21]。雖然目前在骨碎補(bǔ)或續(xù)斷的機(jī)制研究中對(duì)于HIF1ɑ的探討極少，但已發(fā)現(xiàn)HIF1ɑ是其他多種活血或補(bǔ)陽(yáng)類(lèi)中藥中的重要作用靶標(biāo)[22-23]。本研究初步證實(shí)了HIF1ɑ是骨碎補(bǔ)-續(xù)斷發(fā)揮雙向調(diào)控成骨/破骨代謝作用的重要機(jī)制之一，為骨碎補(bǔ)-續(xù)斷藥對(duì)應(yīng)用于治療OP提供了一定的實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。但作用于HIF1ɑ的主要藥物活性物質(zhì)是什么？藥物通過(guò)HIF1ɑ調(diào)控骨代謝的下游具體分子機(jī)制是什么?骨碎補(bǔ)-續(xù)斷藥對(duì)是否還有其他重要的分子靶點(diǎn)和機(jī)制？仍有待進(jìn)一步的研究進(jìn)行證實(shí)或闡明。